2017 Fiscal Year Research-status Report

組織幹細胞を用いた胆汁ドレナージシステムを有する肝様組織構築と術後肝不全への応用

Research Project

Project/Area Number	15K10160
Research Institution	Shinshu University
Principal Investigator	酒井宏司信州大学, 医学部附属病院, 特任研究員 (90645508)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	宮川眞一信州大学, 学術研究院医学系, 教授 (80229806)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2019-03-31
Keywords	肝組織特異的幹細胞 / 肝再生 / 胆管再生
Outline of Annual Research Achievements	平成29年度は研究実施計画における、①マウス肝外胆管幹/前駆細胞の遺伝子発現解析と肝幹前駆細胞との遺伝子発現の比較、②in vitro での肝組織幹/前駆細胞を用いた肝様細胞の作成、至適培養条件の検討、機能解析、③in vitro での肝外胆管幹/前駆細胞を用いた胆管構築ための培養条件の検討、を行った。肝幹/前駆細胞の分離培養技術をすでに確立しているが、肝外胆管系である胆嚢からも、同様の方法で6か月以上継代可能、かつ凍結保存可能な上皮様細胞の分離培養に成功した。これが前駆細胞の性質を持っているか上記の肝幹/前駆細胞と比較検討した。RT-PCRの手法を用いた発現遺伝子の解析では、胆嚢上皮由来前駆細胞よりαフェトプロテイン、アルブミン、サイトケラチン19等、内胚葉系未分化マーカーの発現を確認しており、少なくとも肝前駆細胞類似の性質をもつ内胚葉系譜の細胞集団が含まれることを確認した。さらに免疫染色でも上記蛋白の発現を確認した。肝前駆細胞の肝細胞への分化誘導法について、spheroid 形成によって、アルブミン等、肝細胞マーカーの発現レベルが上昇することを確認した。しかしながら、分離細胞株により分化誘導のレベルや分化のし易さが異なることが確認された。胆嚢上皮由来前駆細胞と肝前駆細胞の共培養で上記のspheroidと連続する構造を形成させるためには、胆嚢上皮由来前駆細胞も肝細胞系譜への分化ができなければならないと考えているが、胆嚢上皮由来前駆細胞は肝前駆細胞と全くおなじ分化誘導の条件では十分な分化は得られないことが分かった。播種細胞密度も分化に影響することがわかった。胆嚢上皮由来前駆細胞を用いて3 次元培養を行い、極性をもった管腔構造を形成するための最適な培養条件を各種培養条件を用いて検討した。肝前駆細胞は培養条件により膵β細胞系譜への分化することが確認された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason 上記のごとく、成体胆嚢上皮から前駆細胞様の性質をもった細胞集団を分離することに成功したが、分化レベルが均一な細胞集団ではないこと確認された。既存の報告でも調べえた限りでは成体肝組織幹細胞において、これに成功している報告はなく、分離細胞株の均一化の培養条件探索に時間がかかっている。また同時に上記細胞集団について肝細胞系譜および胆管上皮系譜への分化誘導実験をおこなっているが、分離細胞株により分化のしやすさが異なる。上記の分化誘導前の分化レベルが強く影響していることが予想され、上記の分離細胞の均一化が本研究課題遂行の大きな問題となっている。各種成長因子等の種類、濃度、組み合わせの再検討を行っており時間を要している。
Strategy for Future Research Activity	上記のごとく培養条件（平面培養だけでなく、浮遊培養やゲルを用いた3次元培養）による前駆細胞の分化レベルの均一化を目指すほか、cell sortingの手法を用いた同一分化レベルの細胞集団の選別を検討している。また、これまで検討した分化誘導でもある程度分化がすすむことは確認できているため、すこし分化をすすめることで同じ分化方向性をもった細胞集団を選別し、これにさらに分化誘導をかけ、肝細胞系譜に分化した細胞集団と胆管上皮系譜に分化した細胞集団共培養する方法や、細胞密度を考慮した培養条件を検討している。
Causes of Carryover	研究計画に従って、共培養による分化誘導実験、細胞機能解析、肝障害マウス作成、移植実験等を予定していた。しかしながら、上記のごとく実験計画に遅れがあり、予定していた実験まですすむことができなかったため、次年度使用額が生じた。次年度使用額は共培養による分化誘導実験、細胞機能解析、肝障害マウス作成、移植実験の実施に使用するとともに、実験成果を学会発表、論文発表に使用する計画である。