2016 Fiscal Year Research-status Report
脂肪肝の再生に於けるオートファジーの役割と分子機序の解明
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15K10167
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
池上 徹 九州大学, 大学病院, 助教 (80432938)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
副島 雄二 九州大学, 医学研究院, 准教授 (30325526)
池田 哲夫 九州大学, 大学病院, 准教授 (60585701)
調 憲 群馬大学, 大学院医学系研究科, 教授 (70264025) [Withdrawn]
吉住 朋晴 九州大学, 医学研究院, 准教授 (80363373)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | オートファジー / 肝再生 / 脂肪肝 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究に於いては肝再生に於けるオートファジーの役割の解明を行い、さらに脂肪肝におけるオートファジーの働きを明らかにすることを目的としている。我々は、マウス肝切除モデルを確立し、正常肝における再生肝オートファジーの定量化を、LC3を用いた免疫組織染色（オートファゴゾーム）にて行った。Cre-loxPの系を用いて、肝特異的にオートファジー関連遺伝子(Atg5)のノックアウト(KO)マウスを作成した。さらに、70%肝切除時の再生肝を経時的に採取し、肝重量体重比、BrdU取り込み率、細胞周期調節蛋白質CyclinD1の活性、細胞周期S期への移行、血清ALT値などを比較検討することで、オートファジーの役割を明らかにすることができた。電子顕微鏡及びウエスタンブロットによる検討によって、正常肝においてオートファジーは術後1日目をピークに高発現していることが判明した。さらに、オートファジーKOマウスにおいて、核の増殖能の低下、障害蛋白質の蓄積、肝機能の低下早期に認めた。その一因としては、p21蛋白質に起因する細胞周期の遅延(細胞周期G2やS期の減少や、肝組織中ATPの低下を認めた。具体的には肝再生時にオートファジーがBrdU取り込み率の低下、p62蛋白質に強く関わることが示された。予想外にも、それらの原因として、p21蛋白質に起因する細胞周期の遅延(細胞周期G2やS期の減少、CyclinDの低発現)や細胞老化(cell senescence)の促進が考えられたことが、本研究による新規発見であるとともに、病的肝における再生遅延の機序解明に深くつながると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
上記の通り正常肝における再生肝のオートファジーの役割を明らかにすることができた。具体的には、肝特異的にオートファジー関連遺伝子(Atg5)のノックアウト(KO)マウスを用いることで、肝再生時にオートファジーが核の増殖能の低下(BrdU取り込み率の低下)、障害蛋白質の除去(p62蛋白質)、肝機能の維持(AST/ALT値、血清アルブミン値)に強く関わることが示された。予想外にも、それらの原因として、p21蛋白質に起因する細胞周期の遅延(細胞周期G2やS期の減少、CyclinDの低発現)や、肝組織中ATPの低下、細胞老化(cell senescence)の促進が考えられたことが、本研究による新規発見であるとともに、病的肝における再生遅延の機序解明に深くつながると考えられた。
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| Strategy for Future Research Activity |
dB/dBマウス（肥満、糖尿病、脂肪肝）マウスモデルにおいて、70%肝切除術を施行し(大量肝切除モデルは90%肝切除)、術後1・2・4・7日目の肝組織を採取する。ATP assay kit(Bio Assay Systems, EATP-100)を用いて、ATP産生量を定量化する。②初代培養の肝細胞における、ミトコンドリア膜のpermeabilityの測定を行う。測定は、Mit-E-φ Mitochondrial Permeability Detection Kit (BIOMOL, AK-116)を用いる。また、ミトコンドリア膜の障害原因としてROSの定量化を行う。測定は、Dichlorofluorescein diacetate assay (FACS)を用いる。③上記組織を用いて、ズダンⅢ染色、オイルレッド染色を行い、肝再生に伴う肝脂肪化を定量化する。さらに、オートファジーの標識マーカーであるLC3の蛍光染色を行い、上記の脂肪免疫染色との2重染色を行い、脂肪とオートファジーとの関係を形態的に評価する。これらの検討により脂肪肝と正常肝におけるオートファジーの動態の違いを明らかにする。
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Research Products
(2 results)
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[Journal Article] p62 Promotes Amino Acid Sensitivity of mTOR Pathway and Hepatic Differentiation in Adult Liver Stem/Progenitor Cells.2017
Author(s)
Sugiyama M, Yoshizumi T, Yoshida Y, Bekki Y, Matsumoto Y, Yoshiya S, Toshima T, Ikegami T, Itoh S, Harimoto N, Okano S, Soejima Y, Shirabe K, Maehara Y.
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Journal Title
J Cell Physiol.
Volume: 232
Pages: 2112-2124
DOI
Peer Reviewed
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