肝虚血再灌流傷害におけるマイトファジー機構の解明と新規予防法の開発

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K10173
• Research Institution: Jikei University School of Medicine
• Principal Investigator: 矢永 勝彦 東京慈恵会医科大学, 医学部, 教授 (70220176)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 白井 祥睦 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助教 (10785364)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 肝虚血再灌流障害 / マイトファジー / Parkin / ミトコンドリア / アデノウイルスベクター

Outline of Annual Research Achievements

本研究は肝切除術または肝移植における虚血再灌流障害についてマイトファジーに焦点をあて、その機構を解明するものである。さらにマイトファジーのイニシエーターであるParkin遺伝子を導入することにより、虚血再灌流障害の新たな予防法を証明する。本研究は細胞培養実験および動物実験において検証され、実証された結果は将来的に臨床研究への応用を目標とするトランスレーショナルスタディである。さらにPARK2への介入による虚血再灌流障害の軽減策も世界初の試みとなる。オートファジーと肝虚血再灌流障害との関係は過去にいくつか報告があるものの、いずれもオートファジー亢進の最下流を確認するにとどまっており、本質は未解明なままである。我々はマウスを用いた虚血再灌流モデルを作成し、Parkinと虚血再灌流障害との関係を評価する。また初代肝細胞を確立し、疑似的な虚血再灌流モデルを作成し、In vitroでのメカニズムを解明する。またアデノウイルスベクターを用いてPARK2遺伝子を導入し、Parkin強制発現による効果を検証する。またPARK2ノックアウトマウスを用いて同様に遺伝子導入し、メカニズムの解明を行う。現時点において実験に必要な学内各種委員会の承認を得た。またIn vivo実験における虚血再灌流モデルを作成し、虚血再灌流モデルにおけるアポトーシスとオートファジーの変化について検証を行った。PARK2ノックマウスの繁殖を行い、実験を開始した。アデノウイルスベクターを作成した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本学の動物実験倫理委員会の承認を得て実験を開始した。C57BL/6jを用いて虚血再灌流モデルを作成した。マウスは麻酔下に回復し、血管クリップを用いて左葉および中葉を選択的に血流遮断し（70％虚血）、任意の時間経過後に血管クリップを外して再灌流した。再灌流後は0時間から48時間まで経時的な評価を行った。阻血時間は20分、30分、60分に設定し、各条件で検討を行った。再灌流後の肝障害を肝逸脱酵素,アポトーシス関連タンパク（Cytochrome C, Cleaved Caspase-9, Cleaved PARP)、病理学的評価、電子顕微鏡による形態学的評価を行った。再灌流後は1時間から肝逸脱酵素の上昇を認め、6時間後をピークに漸減する傾向を認めた。同時にアポトーシス関連タンパクは再灌流後1－6時間後に発現が最も強く、その後漸減した。HE染色では60分虚血では再灌流後1時間より出血性変化を認め、その後は壊死領域が拡大した。電子顕微鏡による評価では膨化したミトコンドリアを観察した。20分虚血の病理評価では軽度の出血性変化をみとめたものの壊死性変化は認めなかった。Parkinの変化は再灌流後24時間以降に発現の増強を認め、アポトーシスと相反する挙動を示した。一方、PARK2ノックアウトマウスであるB6.129S4-Park2(tm1shn)/Jを繁殖し、上記とマウスと同様の条件で虚血再灌流障害を与えた。現在、回収した血清、タンパク、病理を解析中である。またpFC14K HaloTag CMV Flexi Vectorにクローニング下PARK2を導入しプラスミドを作成した。その後、アデノウイルスを用いたベクターを作成した。In vitroでは窒素を用いて低酸素環境を整備した。

Strategy for Future Research Activity

今後の研究推進策は当初研究方針から大きな変更はない。変更点としてはIn vitroの系に関して初代肝細胞の樹立を毎回行うのが煩雑であるため、分化度の高いがん細胞を用いることとした。癌細胞を用いる方法は虚血再灌流障害の研究において過去に多く用いられている。オートファジーおよびParkin発現が虚血再灌流に対して保護的な働きをしていることを示す。マイトファジー阻害によるアポトーシス評価を行う。マイトファジー阻害剤（mdivi1）を用いてマイトファジー減衰を確認し、虚血再灌流障害後のアポトーシスの評価および細胞活性を評価する。同時にPARK2ノックアウトマウスを用いて、肝虚血再灌流障害の増悪を評価する。PARK2導入アデノウイルスベクターを用いてIn vitro、In vivoにおけるParkin強制発現を確認し、虚血再灌流障害時にマイトファジーおよびアポトーシスに与える影響を確認する。

Causes of Carryover

本年度はPARK2ノックアウトマウスの検体を用いた解析に至らなかった。またアデノウイルスベクターの作成を学内で行ったため支出が抑えられている。アデノウイルスベクター導入の研究を行わなかった。当該実験にかかる予定であった助成金額が次年度に使用する予定である。

Expenditure Plan for Carryover Budget

上記理由に基づき繰り越された助成額を本年執行する予定である。採取した検体の解析およびベクター導入後の評価を行う。