2015 Fiscal Year Research-status Report

hANPによる心筋細胞内PPARγ賦活系の解明と心筋虚血再灌流障害の抑制への応用

Research Project

Project/Area Number	15K10206
Research Institution	Tohoku University
Principal Investigator	川本俊輔東北大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (20400244)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	齋木佳克東北大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (50372298) 本吉直孝東北大学, 医学(系)研究科(研究院), 非常勤講師 (40375093) 河津聡東北大学, 大学病院, 助教 (80633685) 堀井明東北大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (40249983) 阿部高明東北大学, 医工学研究科, 教授 (80292209) 西條芳文東北大学, 医工学研究科, 教授 (00292277)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2018-03-31
Keywords	心筋虚血再灌流 / hANP / PPARγ
Outline of Annual Research Achievements	本研究は心筋虚血再灌流障害におけるPPARγ(peroxisome proliferative activating receptor γ) を介したANP (atrial natriuretic peptide) の心筋保護経路の存在を明らかにすることを目的としている。本研究を進めるにあたり、まずブタ心筋虚血再灌流モデルの作成を行った。まず全身麻酔の方法を確立させ、正中切開での開胸を行うこととした。血行動態の測定系を確立し、左冠動脈前下行枝を30分遮断してその後再灌流させ、1時間ごとに4時間目まで経過を追った。その後犠牲死させ、心筋組織を採取した。虚血によりブタの心臓は容易に心室細動におちいるため、安定した実験を行うための工夫を行い、数頭について虚血再灌流4時間後まで実験を行い得た。合成ANPであるhANP (human atrial natriuretic peptide) を投与した群・投与しない群に分けて実験を行い、血行動態の変化を比較した。両群で再灌流中に血行動態の指標であるdP/dTの低下がみられたが、その低下の仕方には群間で違いがみられた。しかし、この段階で有意な血行動態上の優劣はみられなかった。その他、血圧や心拍数・中心静脈圧・心拍出量・左室拡張終期圧といったパラメータの解析を行っている。心筋組織は虚血中心部、辺縁部、非虚血部の3領域から採取した。この組織においてqRT-PCRを行い、PPARγおよびその下流分子であるLXRα (Liver X receptor α) のmRNA発現量の解析を行っている。また、PPARγおよびLXRαタンパクの発現量をWestern blotting法にて解析するため、まずPPARγタンパクのpositive controlを求めた。そのために、マウスの3T3 L1 cellを培養・分化させ、ここタンパクを抽出してWestern blottingによる評価を行った。これらの解析を通して、分子レベルでのANP反応系の解明を行うとともに血行動態評価についても更なる解析を行っていく。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason まずブタ心筋虚血再灌流モデルをつくるところから始まったが、当初は麻酔薬の量の調整や開胸法に試行錯誤が必要であり、虚血から致死性の不整脈を起こし死にいたるブタも多かった。至適な麻酔深度・呼吸器設定を得るまでにさまざまな条件の調整が必要であり、開胸手技の向上や冠動脈の遮断位置の検討、不整脈対策等を経て、固定した条件で比較的安定した血行動態を保つことができるようになった。この条件のもと、hANPの投与・非投与による2群について当面の比較をすることができた。血行動態の指標として当初はエコーを直接にあてて評価していたが、測定の誤差が大きく、左室拡張終期圧とdP/dTを主な指標としてデータを集めている。血行動態変化以外の心筋障害の指標として血中のCK-MB、トロポニンＴの測定を行っている。採血は虚血前と再灌流後1時間ごとに行い、そのピーク値での比較を行っている。組織評価に関しても分子レベルでの各反応分子の発現評価を開始しており、mRNAの発現に関するデータが出始めている。
Strategy for Future Research Activity	hANP投与群・非投与群の2群について、十分なN数で血行動態・心機能の比較を行い、hANPの虚血再灌流障害に対する保護効果の有無・程度を確認していく。同時にPPARγおよびその下流分子であるLXRαのmRNA発現およびタンパク発現を評価し、hANPによるPPARγの誘導効果について検討していく。また、PPARγのantagonistを用いて、これを単独投与した群、hANPとPPARγ antagonistを同時に投与した群を用いて同実験を行う。antagonist投与単独で心機能がどう変化するかを評価し、それをもとにhANP投与群及びhANP＋PPARγ投与群の心機能とを比較し、hANP投与による心保護効果がどの程度PPARγを介しているかを明らかにしていく。 PPARγの発現の評価については、LXRα以外の下流分子にも着目し、その下流分子の評価を通じてPPARγの活性をより細かく評価することも考慮している。現在のモデルでの心機能評価でhANPの有無による優劣が分かりにくい場合には、人工心肺を用いた実験系を考え、大動脈遮断による心臓全体の虚血やhANPの心臓への直接投与といった改変・応用も検討し、その中でPPARγがどう働くかといった考察を加える可能性がある。将来的には開心術や心移植における新たな心保護戦略の理論的裏付けの一つになり得ることを見据えている。
Causes of Carryover	今年度内で使用できるブタの頭数を調整しながら行い、他、麻酔薬・試薬・分子評価のためのキット・抗体等を購入し、ほぼ予定額を消費した。ブタの飼育日数によっても経費が変わり、試薬の変更等もあり、微調整によっても約1万円の端数が生じている。これを次年度に繰り越すこととする。
Expenditure Plan for Carryover Budget	hANP投与群・非投与群の実験を行うためのブタが更に必要であり、この実験に伴う麻酔薬・薬剤の調達も必要である。また、PPARγ antagonistを用いた実験系にも相当数のブタが必要であり、不整脈で死亡するブタの分も含めた経費が必要である。ブタの飼育費も日数分必要になる。qRT-PCRやWestern blottingによる分子評価に関しても適宜試薬の購入が必要であり、場合により測定機器の購入が必要となる場合がある。採血サンプルの測定費用、病理組織スライド・免疫染色に関わる費用もあり、こういった経費に配分額をあてる見込みである。