易破裂大型脳動脈瘤の新規動物モデルとヒト臨床標本による破裂防止薬剤治療法の開拓

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K10287
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 中山 若樹 北海道大学, 医学研究科, 講師 (40421961)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 森脇 拓也 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 客員研究員 (30597464) [Withdrawn] ; 穂刈 正昭 北海道大学, 医学研究科, 客員研究員 (30622807) ; 鐙谷 武雄 北海道大学, 大学病院, 助教 (80270726) ; 数又 研 北海道大学, 大学病院, 講師 (60634144) ; 寳金 清博 北海道大学, 大学病院, 教授 (90229146)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 脳動脈瘤 / ラット / 動物モデル / くも膜下出血 / 脳動脈瘤破裂 / ニトロ化合物 / 高血圧 / 血行力学的負荷

Outline of Annual Research Achievements

脳動脈瘤の破裂機構を解明するための第1段階として、易破裂性大型脳動脈瘤の頭部都モデルを確立することを目指した。従来のラット脳動脈瘤モデルは、左総頸動脈結紮によって血行力学的な負荷を与え、両側腎動脈後枝の結紮と高塩分食による高血圧を誘導維持しつつ、ニトロ化合物を餌に含有させて血管壁障害を惹起するものだが、誘導される動脈瘤はヒトで言えば初期病変にすぎないごく小さいものであり、破裂することはない。
そこで手術方法と高塩分食は同一条件のままで、ニトロ化合物の投与方法を、安定なフマル酸化合物に変更し、投与量が明確にコントロールできる腹腔内投与を1週間毎に行う方法を行った。投与量と飼育期間でA群（n=31, 400mg/kg, 4w）、B群（n=31, 400mg/kg, 8w）、C群（n=27, 2800mg/kg, 8w）、D群（n=13, 2800mg/kg, 12w）へ分類し、血圧変化・死亡率・瘤誘導率・誘導部位を評価した。
いずれの群も高血圧が誘導された。high-dosのC・D群では単回投与／週では致死的だったが、半量を2連日投与／週により長期生存を得た。Low-doseのA・B群間の比較では死亡率（12.9% vs 16.1%, p=0.053）や誘導率（66.7% vs 69.2%, p=0.871）に有意差はみられなかった。しかし、同一飼育期間群の比較では、B群と比してC群で誘導率が有意に高く（66.7% vs 29%, p=0.0042）、死亡率に有意な悪化は無かった。そしてC群の22.2%に大型瘤を誘導することができた。
ここまでで従来よりも明らかに大型の動脈瘤を誘導することに成功しているが、薬剤投与実験に移行する前に、さらに誘導率を上げるべく、メスのラットで卵巣摘出して閉経後と同じ状況を作り、さらに外頚動脈系も結紮して血行力学的負荷を増す方法を試行中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

これまでの実験で、約70%近い高確率で動脈瘤を誘導することができ、そのうち2割以上が大型嚢状動脈瘤であったことは、破裂を目指す脳動脈瘤の動物モデルとしては現時点でも相当に画期的な成果である。
本研究の中で最も難渋することが予想されたのは、この大型動脈瘤モデルの確立であったが、1年目ですでにかなりの進捗が得られている。ただし、今回行った実験群の飼育期間中には、実際の動脈瘤破裂は1例しか認められていない。また、できれば大型動脈瘤誘導率ももう少し高い確率を得たい。モデルの改変によって、いかほどの確率で破裂現象が起きるかに応じて、今後の研究進捗はある程度左右されることは予想されるため、2年目では、より理想的なモデル作成方法を検討した。
具体的には、メスの卵巣摘出を加え、ヒトで動脈瘤の発生率および破裂率の高い閉経後の女性と同じ状況を作り、さらに血行力学的負荷を増すために外頚動脈系をも結紮する手法を加えることにした。手術手技は従来の手技の延長上にあるため容易であり、その効果を現在確認しているところである。手技はほぼ確立したので、今後例数を増やしていくことができる体制になった。
また、aliveで動脈瘤形成を確認する方法として、経頭蓋エコーを使用することにした。頭蓋骨をあらかじめ一部削除しておくことで主幹動脈の評価は可能であり、今後の実験進行の加速に寄与すると思われる。

Strategy for Future Research Activity

本研究では、易破裂・大型脳動脈瘤の動物モデルに対して、抗血小板剤などの薬剤投与実験を行い、破裂率に対する効果を調査することを最終目標にしている。しかしそれに先立って、大型瘤の誘導率をさらに向上させることと、動脈瘤が誘導された個体をaliveの状態で特定し、それを選択的に長期飼育できる体制を作る必要があった。
大型瘤誘導率のさらなる向上のために、メスのラットを用いて、前術の処置に加え、卵巣摘出も併せて施すことを現在試行している。これは、人で有病率の高い閉経後の女性を反映させようとするものである。
動脈瘤誘導の有無をaliveで評価する方法としては、エコーのドップラーモードを活用することにした。あらかじめ頭蓋骨を一部削除しておくと、麻酔下で、脳底動脈・内頚動脈・中大脳動脈水平部・前大脳動脈近位部をそれぞれ道程することは可能であることは確認されたので、これを定期的に行うことで動脈瘤誘導を検出できそうである。
これらの手法がほぼ確立しつつあるところなので、大型の動脈瘤誘導率、破裂率、死亡率を検証したうえで、いよいよ薬剤投与実験に移行していく予定である。用いる薬剤としては、抗血小板剤、スタチン、血管内皮保護薬などを考えている。評価方法としては、破裂率を比較検討することはもちろんだが、破裂する前に病理標本として取得し、壁在もしくは壁内での血栓形成や炎症反応を免疫染色で評価し、内壁の構造すなわち内皮の有無および形体を走査電子顕微鏡的に評価することも併せて行っていく予定である。

Causes of Carryover

2年目では、薬剤投与実験にはまだ移行せず、さらに動物モデルの改変を重ねる作業が中心であった。いくつかの手法を限定的な数のラットに施して、その手技を1例ごとに確認する研究であったため、実際に使用するラット数はやや少なめで、また、まだ薬剤を購入していないことによる。

Expenditure Plan for Carryover Budget

改変動物モデルの手法はおおむね確立したので、次年度はいよいよ条件数およびそれぞれの個体数を増やして実験を重ねることになる。
使用するラット数も多くなり、また薬剤購入も必要になるため、次年度使用額を合算した助成金をそこに使用する計画である。