2016 Fiscal Year Research-status Report
脊柱靭帯骨化症の骨化抑制に向けたmicroRNA標的核酸医療の開発
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15K10403
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| Research Institution | Shiga University of Medical Science |
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Principal Investigator |
彌山 峰史 滋賀医科大学, 医学部, 助教 (60362042)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 後縦靭帯骨化 / 黄色靭帯骨化 / 内軟骨性骨化 / マイクロRNA / サイトカイン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
脊柱靱帯（後縦靱帯、黄色靱帯）骨化症は脊柱管内へ骨化巣が増大し、進行性かつ重篤な脊髄症状を生じうる疾患である。本症に対する有効な治療法は神経症状を緩和・改善させるための投薬、リハビリテーションや脊髄の圧迫を除去する外科的治療が中心であり、靭帯骨化の進行を抑制する治療は存在しない。本研究の目的は脊柱靭帯骨化の疾患形成に関与する因子としてmicroRNA（miRNA）に着目し、これらが標的とする骨化誘導因子の発現解析を行うことである。
脊柱靭帯骨化の病態には、加齢による退行性変化、代謝内分泌異常、生活環境素因など種々の因子の関与が報告されてきた。特に遺伝的背景についてはコラーゲン遺伝子の発現異常が報告されて以降、ゲノム・遺伝子解析が進められ、徐々に本症の病態は明らかとなってきている。しかし、骨化巣形成が脊椎領域に限局すること、骨化形態、罹患高位数、骨化伸展様式には大きな個人差が存在することなど、本症の治療を発展させていくうえで重要な疑問点は未だ残されている。
病理学的には脊柱靭帯骨化における骨形成は内軟骨性骨化に準じており、骨化巣に近接して軟骨細胞の層状配列からなる骨化前線が存在する。これまでの研究にて骨化靭帯由来の培養細胞の特性を観察し、Runx2、Osterixといった骨芽細胞分化を促進させる転写因子のmRNA発現が亢進しており、さらに外的負荷を加えるとこれらの発現量は有意に上昇することを明らかにできた（平成25-26年度（若手研究B））。
本研究の目的は、脊柱靭帯骨化の骨化前線部における細胞分化を規定する因子について解析することで、骨化抑制療法に向けた新たな知見を得ることである。特にmRNAの翻訳機構を調整する役割を有するmiRNAに着目し、その標的遺伝子や下流に存在する蛋白質の発現について検討している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
miRNAは19-24塩基からなる一本鎖RNAであり、標的とするmRNAに結合して蛋白質の翻訳を抑制することで作用を発揮し、組織・細胞特異性のみならず時空特異性を有して、生体の発生過程での形態形成、細胞分化調節といった高次機能を精密に制御している。この機構は骨代謝にも存在し、骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収のバランスを制御し、恒常性を維持すると考えられる。
頚椎後縦靭帯骨化症に由来する培養細胞に対して網羅的miRNA解析を行うと、頚髄症（非骨化靭帯）由来の培養細胞と比較して177因子の有効性を認めるプローブが抽出された。このうちp-value <0.05かつlog2 ratio >1を満たしたのは4プローブのdown regulationであり、このmiRNAが標的とする遺伝子はWnt signaling、BMP-Smad signalingに関連するreceptor、regulatorであった。またこれらのmiRNAの標的因子にはIL-1、IL-6といったサイトカインも存在した。
組織切片における免疫染色による局在を観察すると、Wnt signaling receptorであるLrp6は新生血管周囲の未分化間葉系細胞に陽性であり、Wnt3a、beta-cateninは骨化巣近傍の分化過程にある軟骨細胞に強く発現していた。またサイトカイン発現に関してsuspension arrayを行うと、靭帯骨化由来の培養細胞ではIL-1、IL-6、basic FGF、VEGFの発現量が有意に高値となっていた。
現在の進捗としては、上記のように脊柱靭帯骨化に特異性の高いmiRNAが抽出可能であり、その標的因子の発現についての解析を進めている段階である。
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| Strategy for Future Research Activity |
上記の結果については日本整形外科学会、日本リウマチ学会などにて学会発表を行い、考察、討論を行っている。また、培養細胞に対する網羅的miRNAおよびその標的遺伝子の発現については、データ解析を行った上、現在英文雑誌に投稿中である。靭帯骨化とサイトカインに関する結果については、症例数を増やした上で統計解析処理を行い、英文論文として投稿予定である。
今後の研究計画としては、培養細胞に対してサイトカイン、成長因子の過量負荷または発現阻害を行い、その際のmiRNAの発現量の変化、骨芽細胞分化に関連する標的因子の発現変化について観察を行う予定である。さらなる研究を進め、これらの成果については学会発表、英文論文への投稿により広く公開する計画である。
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| Causes of Carryover |
平成28年度の研究では脊柱靭帯由来の培養細胞に対して、細胞培養に関連する溶液、試薬、細胞保存環境の構築のために研究費を使用した。また、免疫組織化学染色に関連した1次抗体、2次抗体の購入、英文論文の作成に伴う英文構成費に研究費を使用した。
培養細胞に対するRT-PCR、ウエスタンブロッティング、サスペンションアレイによる解析を予定していたが、手術より採取する靭帯組織を対象としているため、症例数が整わなかった。したがって次年度使用額が生じたものと考えられる。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
これまでの研究により、脊柱靭帯骨化に関連したmicroRNAを抽出することができた。このmiRNAの標的遺伝子の発現解析目的に、RT-PCR、ウエスタンブロッティング、サスペンションアレイによる研究を予定しており、次年度使用額を併せて使用する予定である。
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