2015 Fiscal Year Research-status Report
| Project/Area Number |
15K10406
|
|---|
| Research Institution | Kobe University |
|---|
Principal Investigator |
前野 耕一郎 神戸大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (70403269)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
西田 康太郎 神戸大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (00379372)
由留部 崇 神戸大学, 医学部附属病院, 医員 (10514648)
角谷 賢一朗 神戸大学, 医学部附属病院, 助教 (10533739)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
|
| Keywords | 椎間板変性 / オートファジー / セネッセンス / アポトーシス / mTOR / Raptor / Rictor / siRNA |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
研究計画通り、ヒト椎間板髄核細胞株にmTOR・Raptor・Rictorに対するsiRNAをリポフェクション法で導入し、ウエスタンブロット(以下、WB)法で細胞自食作用（オートファジー）の活性に関係する各蛋白質の動向を検討した。さらにIL-1βによる細胞刺激下に、細胞死（アポトーシス）や細胞老化（セネッセンス）、細胞外基質分解に関係する遺伝子の評価を、TUNEL染色、WB法、定量PCRで検討した。結果であるが、導入した各siRNAが標的蛋白の発現を特異的に抑制することを確認した（mTOR 56%，Raptor 63%，Rictor 53%）。また、これらのsiRNA導入後には全群でp70/S6Kのリン酸化が減少し、さらにLC3とp62/SQSTM1で観察したオートファジー活性も全群で増加することが明らかとなった。一方、Aktのリン酸化はmTOR・RictorのsiRNA導入群で減少していて、mTORC2以下の遺伝子シグナルを広範に抑制することが示唆されたものの、Raptor のsiRNA導入群ではAktのリン酸化がむしろ増加していた。さらにIL-1βによる細胞刺激を加えると、RaptorのsiRNA導入群ではコントロール群を比べ、TUNEL陽性細胞の増加を有意に抑制するとともに、アポトーシスに関係するcleaved PARP、caspase-9、セネッセンスに関係するp16/INK4A、細胞外基質分解酵素であるMMP-2、-3、-13、ADAMTS-4の発現がいずれも抑制されていた。以上より、Raptor の機能抑制がAktを活性化させつつmTORC1のみを抑制することでオートファジーの誘導とアポトーシス・老化・基質分解の抑制を来たすことが示された。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成27年度の「研究計画・方法」の要点は、ヒト椎間板髄核細胞の不死化細胞株内に、オートファジーに必須の分子であるATG-5遺伝子や、オートファジーを抑制的に制御しているmTORおよびmTOR結合蛋白質であるRaptor・RictorのsiRNAを導入し、細胞刺激下に下流遺伝子の動向評価を詳細に行うというものであった。研究実績の概要に記載の通り、mTORおよびmTOR結合蛋白質のsiRNA導入実験において、今のところ当初の想定通りの結果が出ており、おおむね順調に進展していると考えている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
平成28年度以降は研究計画通り、In vivo実験として、モデルとして確立しているラット尾椎の創外固定型椎間板圧迫モデルを使用した実験を実施する予定である。SDラットの尾椎に創外固定器を装着させて、椎間板に一定の加圧を加えることのできるモデルである。ラット尾椎椎間板にmTOR、mTOR結合蛋白質のRaptor・Rictorの各siRNAを導入した後、本モデルを使用して椎間板に圧迫を加え、コントロール群と比較して椎間板の形態学的・組織学的な評価を行う予定にしている。さらに圧迫を加えた椎間板の髄核細胞を採取して免疫染色を行うとともに、平成27年度に行う予定の実験内容に準じて、オートファジー、アポトーシスの各関連蛋白質や酵素のの定量評価を行う予定としている。我々の研究グループの実験手法として確立している方法であるが、ラット尾椎椎間板の形状が小さいため採取できる椎間板髄核細胞も非常に少量である。このため複数のラットを同時に実験に使用するなど、実験の効率化を図る予定としている。
|
| Causes of Carryover |
当初の研究計画では細胞培養に必要な試薬（DMEM、FBS など）や抗体試薬、Western-blotting 試薬、RT-PCR キット、PCR-arrayキット、サイトカインassay試薬など、主に細胞培養やIn-Vitroでの遺伝子評価を行うための試薬を予算として計上した。その理由としては、研究計画に記載の通り、複数の遺伝子の動向を評価し、さらにその再現性を獲得するために、特に抗体試薬、Western-blotting 試薬、RT-PCR キットに予算の重点をおいて試算を行ったからである。しかしながら研究実績の概要や現在までの進捗状況に記載の様に、おおむね順調に研究成果が出た理由の一つには、これらの再現性獲得実験の回数が少なくて済んだことが挙げられると考えている。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成28年度以降は、研究計画書に記載の通り、主にSDラットを用いたIn-Vivoの実験を実施する予定である。ラットの尾椎椎間板は非常に小さくて実験操作は難しく、またこれまでのIn-Vitroでの実験とは異なり、実験結果の再現性獲得にも難渋する可能性があると考えている。よって、当初の予算に加えて次年度使用額として繰り越した上記金額を併せ、慎重に実験を進めることでこれらの問題に対応をしていきたいと考えている。
|
Research Products
(2 results)
