治療標的分子探索を目指したNF-κBシグナルの関節軟骨維持・変性制御機構の解明

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K10460
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 小林 寛 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (20407951)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 澤田 良子 東京大学, 医学部附属病院, 特任臨床医 (30648308) ; 矢野 文子 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (80529040)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: NF-κB シグナル / 変形性関節症

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、関節軟骨に置けるNF-κBシグナルの作用を明らかにし、変形性関節症の治療ターゲットを探索し、新規治療を開発することを目的としている。まず、変形性膝関節症モデルを用いて、NF-κBシグナルの活性化を経時的に解析した。変形性関節症モデルでは、おおよそ8－12週程度で関節軟骨が強く変性してくるので、変性を起こす前段階の状態を解析するために２、４、６、８週の時点で解析を行った。それぞれ3検体ずつ解析し、組織の解析を行った。変形性関節症が経時的に進行していることを確認した上で、免疫染色を行い、NF-κBシグナルの活性化について時間的、空間的なパターンを把握した。これに伴い、関節軟骨の変性に関与するAdamts5, Hif2a,Mmp13などについても同時に解析した。また、NF-κBシグナルの転写因子であるRELAを細胞株に強制発現し、RELAがコントロールと比較して確実に発現していることを確認した。これを用いてマイクロアレイを行い、RELAの下流因子の解析を行っている。これとChIPシーケンスの結果を照合して、統合的にRELAの下流因子の探索を行っている。今後は、これにより候補に挙がった遺伝子について先述した変形性関節症モデルの組織を用いて発現解析を行う予定である。また、タモキシフェン誘導型軟骨特異的Cre作動マウスを用いて、Relaのホモ、ヘテロノックアウトマウスを作成した。これを用いて変形性関節症モデルを作成し、Relaが軟骨変性に与える影響について解析した。これにより、Relaノックアウトによる軟骨変性に変化がみられた。現在、その作用メカニズムについて解析を行っているところである。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

①変形性関節症におけるNF-κB シグナル活性化の解析
変形性膝関節症モデルを用いて解析した。変形性関節症モデルでは、おおよそ8－12週程度で関節軟骨が強く変性してくるので、変性を起こす前段階の状態を解析するために２、４、６、８週の時点で解析を行った。それぞれ3検体ずつ解析し、組織の解析を行った。変形性関節症が経時的に進行していることを確認した上で、免疫染色を行い、NF-κBシグナルの活性化について時間的、空間的なパターンを把握した。これに伴い、関節軟骨の変性に関与するAdamts5, Hif2a,Mmp13などについても同時に解析した。また、NF-κBシグナルの転写因子であるRELAを細胞株に強制発現し、RELAがコントロールと比較して確実に発現していることを確認した。これを用いてマイクロアレイを行い、RELAの下流因子の解析を行っている。これとChIPシーケンスの結果を照合して、統合的にRELAの下流因子の探索を行っている。今後は、これにより候補に挙がった遺伝子について先述した変形性関節症モデルの組織を用いて発現解析を行う予定である。
②ノックアウトマウスを用いたNF-κB シグナルの関節軟骨の維持・変性への関与の検討
タモキシフェン誘導型軟骨特異的Cre作動マウスを用いて、Relaのホモ、ヘテロノックアウトマウスを作成した。これを用いて変形性関節症モデルを作成し、Relaが軟骨変性に与える影響について解析した。これにより、Relaノックアウトによる軟骨変性に変化がみられた。現在、その作用メカニズムについて解析を行っているところである。
以上、本年度研究計画していた内容について計画通りに進行しており、今後も計画に準じて解析を行って行く方針である。

Strategy for Future Research Activity

本年度行った①変形性関節症におけるNF-κB シグナル活性化の解析、②ノックアウトマウスを用いたNF-κB シグナルの関節軟骨の維持・変性への関与の検討について継続して行って行く方針である。②においては、Relaの関節軟骨における作用についてin vitroで解析を行い、詳細なメカニズムを明らかにして行く予定である。また、研究計画通り、NF-κB シグナルをターゲットとした新規治療薬の探索も行って行く予定である。

Causes of Carryover

実験がおおむね順調に進み、当初計画していた費用以下でおさまったため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

変形性関節症におけるNF-κB シグナル活性化の解析、ノックアウトマウスを用いたNF-κB シグナルの関節軟骨の維持・変性への関与の検討に必要な試薬、マウス、in vitroで解析にかか諸費用。