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2016 Fiscal Year Research-status Report

炎症性サイトカインによる破骨細胞分化を制御するグルタチオン応答性タンパク質の同定

Research Project

Project/Area Number 15K10475
Research InstitutionOkayama University

Principal Investigator

藤田 洋史  岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (20423288)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 小渕 浩嗣  岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 講師 (10304297)
Project Period (FY) 2015-04-01 – 2018-03-31
Keywordsグルタチオン / ゲノム編集 / ノックアウトマウス / CRISPR/Cas9 system
Outline of Annual Research Achievements

グルタチオンに関連する破骨細胞分化促進候補分子Aを見出した。このノックアウトマウスを作製するために、CRISPR/Cas9 systemによるゲノム編集の実験系の確立を行った。CRISPR/Cas9 systemは、これまで時間やコストの面で困難であった変異マウスの作出が簡便かつ低コストで行えるため近年注目されている。Cas9 proteinとgRNAを同時に発現するPX458ベクターを用いて、培養細胞でのゲノム編集を試みた。まず、分子AのゲノムをターゲットとしたgRNAを設計し、ベクターの構築を行った。ポジティブコントロールとしてNFATc1をターゲットとして用いた。これらのベクターをマウス線維芽細胞株3T3-L1細胞に、エレクトロポレーションにてトランスフェクトし、ゲノム配列を解析した結果、分子A及びNFATc1のターゲット部位を中心とした配列に変異が認められた。次に、マウス個体でのゲノム編集を行う為、PX458を鋳型としてgRNAをin vitro transcriptionにて合成し、Cas9 proteinとともにマウスZygoteにエレクトロポレーションにてトランスフェクトを行った。偽妊娠マウスにこのZygoteを移植後、得られたEmbryoのYolk sacからゲノムを抽出し、配列を解析した結果、マウス個体でも分子A及びNFATc1で変異導入が行われたことが明らかとなった。またNFATc1変異Embryoでは既報の通り心臓の形成に異常が認められた。このように培養細胞およびマウス個体において、CRISPR/Cas9 systemによるゲノム編集の系が確立できた。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

最も難関であったマウス個体におけるゲノム編集の実験系を確立できており、研究課題の目的を達成する為に、重要な手法の習得に成功した。現在、分子A変異マウス個体の作出を行っており、概ね順調であると判断できる。

Strategy for Future Research Activity

今後、候補分子Aの変異マウスを複数匹作出し、LPSによる骨破壊モデルへの反応を動物用CTシステムを用いて解析する。加えて、組織学的解析を行う為、CT解析済みのマウスを固定後、骨破壊部位のパラフィン切片を作成し、TRAP染色にて破骨細胞の形成を評価する。
これらの解析により、骨破壊における明らかな変化が認められた場合、骨髄マクロファージを取得し、in vitroにおける破骨細胞分化への影響を解析する。

Causes of Carryover

当初予定していた精製分画からの破骨細胞分化促進因子の同定よりも先に、in silicoによる解析で候補分子の選定が出来た。これにより、ゲノム編集マウス作出実験系を前倒しした為、コストが減少した。

Expenditure Plan for Carryover Budget

候補分子の機能解析後、今一度精製分画からの同定に立ち戻り分化の実験系を用いて解析する際に、使用する計画である。

  • Research Products

    (6 results)

All 2017 2016

All Journal Article (3 results) (of which Peer Reviewed: 3 results,  Open Access: 1 results) Presentation (3 results)

  • [Journal Article] Expression analysis of Dickkopf-related protein 3 (Dkk3) suggests its pleiotropic roles for a secretory glycoprotein in adult mouse2017

    • Author(s)
      Junji Inoue, Hirofumi Fujita, Tetsuya Bando, Yoichi Kondo, Hiromi Kumon, Hideyo Ohuchi
    • Journal Title

      J Mol Histol.

      Volume: 48 Pages: 29-39

    • DOI

      10.1007/s10735-016-9703-2

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Two Opsin 3-Related Proteins in the Chicken Retina and Brain: A TMT-Type Opsin 3 Is a Blue-Light Sensor in Retinal Horizontal Cells, Hypothalamus, and Cerebellum2016

    • Author(s)
      Mutsuko Kato, Takashi Sugiyama, Kazumi Sakai, Takahiro Yamashita, Hirofumi Fujita, Keita Sato, Sayuri Tomonari, Yoshinori Shichida, Hideyo Ohuchi
    • Journal Title

      PLOS ONE

      Volume: 11 Pages: 1-23

    • DOI

      10.1371/journal. pone.0163925

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Autopsy Case of Bilateral Optic Nerve Aplasia with Microphthalmia: Neural Retina Formation Is Required for the Coordinated Development of Ocular Tissues.2016

    • Author(s)
      Ohuchi H, Taniguchi K, Miyaishi S, Kono H, Fujita H, Bando T, Fuchizawa C, Ohtani Y, Ohtani O.
    • Journal Title

      Acta Med Okayama

      Volume: 70 Pages: 131-7

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] ノックアウトマウス及びプロテオーム解析を用いたDKK3タンパク質の生理的機能の解明2017

    • Author(s)
      藤田洋史、井上順治、親泊政一、近藤格、公文裕巳、大内淑代
    • Organizer
      第122回日本解剖学会総会・全国学術集会
  • [Presentation] ヘム代謝制御に基づく光感受性物質protoporphyrin IX蓄積機構の研究2016

    • Author(s)
      藤田 洋史, 永川 恵介, 小渕 浩嗣, 荻野 哲也, 近藤 洋一, 井上 啓史, 執印 太郎, 内海 俊彦, 内海 耕慥, 佐々木 順造, 大内 淑代
    • Organizer
      第69回日本酸化ストレス学会学術集会
    • Place of Presentation
      仙台
    • Year and Date
      2016-08-30 – 2016-08-31
  • [Presentation] 抗酸化物質グルタチオンは炎症性骨破壊を促進する2016

    • Author(s)
      藤田 洋史、大野 充昭、青山 絵理子、大内 淑代
    • Organizer
      第34回日本骨代謝学会学術集会 第3回アジア太平洋骨代謝学会議
    • Place of Presentation
      大阪
    • Year and Date
      2016-07-20 – 2016-07-23

URL: 

Published: 2018-01-16  

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