2016 Fiscal Year Research-status Report
炎症性サイトカインによる破骨細胞分化を制御するグルタチオン応答性タンパク質の同定
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15K10475
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
藤田 洋史 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (20423288)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小渕 浩嗣 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 講師 (10304297)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | グルタチオン / ゲノム編集 / ノックアウトマウス / CRISPR/Cas9 system |
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| Outline of Annual Research Achievements |
グルタチオンに関連する破骨細胞分化促進候補分子Aを見出した。このノックアウトマウスを作製するために、CRISPR/Cas9 systemによるゲノム編集の実験系の確立を行った。CRISPR/Cas9 systemは、これまで時間やコストの面で困難であった変異マウスの作出が簡便かつ低コストで行えるため近年注目されている。Cas9 proteinとgRNAを同時に発現するPX458ベクターを用いて、培養細胞でのゲノム編集を試みた。まず、分子AのゲノムをターゲットとしたgRNAを設計し、ベクターの構築を行った。ポジティブコントロールとしてNFATc1をターゲットとして用いた。これらのベクターをマウス線維芽細胞株3T3-L1細胞に、エレクトロポレーションにてトランスフェクトし、ゲノム配列を解析した結果、分子A及びNFATc1のターゲット部位を中心とした配列に変異が認められた。次に、マウス個体でのゲノム編集を行う為、PX458を鋳型としてgRNAをin vitro transcriptionにて合成し、Cas9 proteinとともにマウスZygoteにエレクトロポレーションにてトランスフェクトを行った。偽妊娠マウスにこのZygoteを移植後、得られたEmbryoのYolk sacからゲノムを抽出し、配列を解析した結果、マウス個体でも分子A及びNFATc1で変異導入が行われたことが明らかとなった。またNFATc1変異Embryoでは既報の通り心臓の形成に異常が認められた。このように培養細胞およびマウス個体において、CRISPR/Cas9 systemによるゲノム編集の系が確立できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
最も難関であったマウス個体におけるゲノム編集の実験系を確立できており、研究課題の目的を達成する為に、重要な手法の習得に成功した。現在、分子A変異マウス個体の作出を行っており、概ね順調であると判断できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後、候補分子Aの変異マウスを複数匹作出し、LPSによる骨破壊モデルへの反応を動物用CTシステムを用いて解析する。加えて、組織学的解析を行う為、CT解析済みのマウスを固定後、骨破壊部位のパラフィン切片を作成し、TRAP染色にて破骨細胞の形成を評価する。
これらの解析により、骨破壊における明らかな変化が認められた場合、骨髄マクロファージを取得し、in vitroにおける破骨細胞分化への影響を解析する。
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| Causes of Carryover |
当初予定していた精製分画からの破骨細胞分化促進因子の同定よりも先に、in silicoによる解析で候補分子の選定が出来た。これにより、ゲノム編集マウス作出実験系を前倒しした為、コストが減少した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
候補分子の機能解析後、今一度精製分画からの同定に立ち戻り分化の実験系を用いて解析する際に、使用する計画である。
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Research Products
(6 results)
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[Journal Article] Two Opsin 3-Related Proteins in the Chicken Retina and Brain: A TMT-Type Opsin 3 Is a Blue-Light Sensor in Retinal Horizontal Cells, Hypothalamus, and Cerebellum2016
Author(s)
Mutsuko Kato, Takashi Sugiyama, Kazumi Sakai, Takahiro Yamashita, Hirofumi Fujita, Keita Sato, Sayuri Tomonari, Yoshinori Shichida, Hideyo Ohuchi
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Journal Title
PLOS ONE
Volume: 11
Pages: 1-23
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Presentation] ヘム代謝制御に基づく光感受性物質protoporphyrin IX蓄積機構の研究2016
Author(s)
藤田 洋史, 永川 恵介, 小渕 浩嗣, 荻野 哲也, 近藤 洋一, 井上 啓史, 執印 太郎, 内海 俊彦, 内海 耕慥, 佐々木 順造, 大内 淑代
Organizer
第69回日本酸化ストレス学会学術集会
Place of Presentation
仙台
Year and Date
2016-08-30 – 2016-08-31
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