2015 Fiscal Year Research-status Report
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15K10528
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| Research Institution | National Defense Medical College |
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Principal Investigator |
児玉 光厳 防衛医科大学校(医学教育部医学科進学課程及び専門課程、動物実験施設、共同利用研究, その他部局等, 助教 (00597528)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 麻酔 / 神経 / 管状輸送 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
最終目的としては神経細胞内の脳由来神経成長因子BDNFおよび神経成長因子NGFの管状輸送に対する麻酔薬の影響を調査することであり、そのため可視化可能な量子ドットにより修飾した脳由来神経成長因子BDNFおよび神経成長因子NGFを作成する必要があった。
AviTagと呼ばれる部位特異的ににライシンを挿入した特殊なBDNF（BDNFAvi）およびNGF（NGFAvi）とそのライシンにBiotinを結合させる酵素であるBirAのプラスミドをEcoli由来のコンピテントセルを用い複製し、QIAGEN社ミディプレップを使用し精製することに成功した。
BDNFAviとBirAもしくはNGFAviとBirAの組み合わせをHEK293Cellを培養したディッシュにドロップワイズ法にて投与しTurbofectとBiotinを加え72時間培養するとBDNFおよびNGFに一か所だけBiotinを結合したmBtBDNFおよびmBtNGFを産生し、これらを含む培養液にニッケルアガロースを加え沈降させ溶出バッファを用い精製することができる。
こうして作られたmBtBDNFおよびmBtNGFは市販のストレプトアヴィディンを添加した量子ドットと混和することによりQD-BDNFおよびQD-NGFとなり、マイクロフルイディックチャンバー内で培養されたマウスの海馬初代培養細胞の成長円錐側に投与することで、脳由来神経成長因子BDNFおよび神経成長因子NGFの神経細胞内への取り込み、輸送をライブイメージングにて観察することが可能となり麻酔薬の脳由来神経成長因子BDNFおよび神経成長因子NGFの管状輸送に対する影響を調査できる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
NGFavi、BDNFavi、BirAのプラスミドをコンピテントセルを用いアンプリファイし精製することに成功した
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| Strategy for Future Research Activity |
NGFavi、BDNFavi、BirAのプラスミドをHEK293CellにトランスフェクトしmBiNGFおよびmBiBDNFを分泌させ、精製する。
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| Causes of Carryover |
本年度使用可能な物品費で購入できる適当な物品が見当たらなかった為
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
28年度物品費を加えウエスタンブロット読み取り装置を購入予定
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