2016 Fiscal Year Research-status Report
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15K10528
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| Research Institution | National Defense Medical College |
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Principal Investigator |
児玉 光厳 防衛医科大学校(医学教育部医学科進学課程及び専門課程、動物実験施設、共同利用研究, 病院 麻酔科, 講師 (00597528)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 麻酔 / 神経 / 管状輸送 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
神経細胞内の脳由来神経成長因子BDNFおよび神経成長因子NGFの管状輸送に対する麻酔薬の影響を調査していくために可視化可能な量子ドットにより修飾した脳由来神経成長因子BDNFおよび神経成長因子NGFを作成する必要があった。AviTagと呼ばれる部位特異的にライシンを挿入した特殊なBDNF(BDNFAvi)及びNGF(NGFAvi)と挿入されたライシンとBiotinを結合させる酵素であるBirAのプラスミドをEcoli由来のコンピテントセルを用い複製し、QUIAGEN社製ミディプレップを使用し生成することに成功した。
BDNFAviとBirAもしくはNGFAviとBirAの組み合わせをHEK293を培養したディッシュにドロップワイズ法を用いて投与し、TurbofectとBiotinを加え72時間インキュベーターにて保存することによりBDNFおよびNGFに一か所だけBiotinが結合されているmBtBDNFおよびmBtNGFが産生され、これらを含む培養液にニッケルアガロースを加え沈降させ溶出バッファーをもちいて精製することができる。
このようにして作られたmBtBDNFおよびmBtNGFは市販されているストレプトアビディンを表面に添加されている量子ドットと混和することによりQD-BDNFおよびQD-NGFとなりマイクロフルイディックチャンバーないで培養されたマウスの海馬神経初代培養の成長円錐側に投与することで脳由来神経成長因子BDNFおよび神経成長因子NGFの神経細胞内への取り込み、輸送をライブイメージングにて観察することが可能になり麻酔薬の脳由来神経成長因子BDNFおよび神経成長因子NGFの管状輸送に対する麻酔薬の影響を調査できる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
AviTagと呼ばれる部位特異的にライシンを挿入した特殊なBDNF(BDNFAvi)及びNGF(NGFAvi)と挿入されたライシンとBiotinを結合させる酵素であるBirAのプラスミドをEcoli由来のコンピテントセルを用い複製し、QUIAGEN社製ミディプレップを使用し生成することに成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
BDNFAviとBirAもしくはNGFAviとBirAの組み合わせをHEK293を培養したディッシュにドロップワイズ法を用いて投与し、TurbofectとBiotinを加え72時間インキュベーターにて保存することによりBDNFおよびNGFに一か所だけBiotinが結合されているmBtBDNFおよびmBtNGFが産生され、これらを含む培養液にニッケルアガロースを加え沈降させ溶出バッファーをもちいて精製する。
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