The exploratory research of congenital hydronephrosis using animal model

2018 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15K10631
• Research Institution: Jichi Medical University
• Principal Investigator: 高山 達也 自治医科大学, 医学部, 准教授 (90324350)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 森田 辰男 自治医科大学, 医学部, 教授 (40200422) ; 中井 秀郎 自治医科大学, 医学部, 教授 (50167540) ; 久保 太郎 自治医科大学, 医学部, 助教 (50508744) ; 寺谷 工 自治医科大学, 医学部, 講師 (70373404)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 水腎症モデル動物 / ゲノムDNA解析 / ポリアミン

Outline of Annual Research Achievements

平成30年度はInversed PCR法を用いて、ポリアミン摂取による水腎症発症に関与するゲノムDNA上の遺伝子変化部位または領域を同定するためにLuciferase-Transgenic LEW (Luc-Tg LEW) ラット由来間葉系幹細胞由来のゲノムDNAを抽出し、Luciferase cDNAが組み込まれている部位の解析に進める目的で実施した。我々は平成27-28年度にLuc-Tg LEWラットの 雄8～10週齢にポリアミン含有飼料を経口摂取させる事で水腎症を発症し、その後、飼料よりポリアミンを除去すると水腎症が改善する事を見出した。そこで、水腎症を呈するLuc-Tg LEWラットと呈しないWild-type LEWラットの腎臓組織よりゲノムDNAを抽出した。目的のゲノム領域を明確に特定するために、「Luciferase cDNAおよびプロモーター領域（約1.5kbp）」の前後、約3kbp以上のゲノムDNA断片（全長約7.5kbp以上）が必要である。そこで抽出したゲノムDNAを各種制限酵素（単一）で処理し、切断されたゲノムDNA鎖長が少なくとも7.5kbp以上の領域にスメアバンドが確認されたサンプルのみLigaseを用いて自己閉環させた。尚、用いる制限酵素はLuciferase cDNA領域を切断しない事を条件に選抜した。次にLuciferase cDNA領域内で設計した特異的プライマーを用いてPCRを行い、7.5kbp以上の領域にバンドの有無を確認した。
アガロース電気泳動法により全長7.5kbp以上となるゲノム断片候補を20種類選抜し、ポリアミン摂取による水腎症発症機序に関わる遺伝子領域および遺伝子群を探索する目的で、各候補サンプルの全領域に渡り塩基配列の決定を実施している。