2015 Fiscal Year Research-status Report

卵活性化因子ＰＣＬζの機能解析と精巣内遺伝子導入による男子不妊症治療法の開発

Research Project

Project/Area Number	15K10646
Research Institution	Nagoya City University
Principal Investigator	窪田裕樹名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (10347403)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	林祐太郎名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (40238134) 佐々木昌一名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (50225869) 岩月正一郎名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (70595397) 梅本幸裕名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (80381812)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2018-03-31
Keywords	男性不妊 / PLC zeta / 遺伝子導入
Outline of Annual Research Achievements	マウス精巣のcDNAライブラリーから既知のプライマーを用いて、PCR法によりPLCζ遺伝子(2.2Kb)の全長にわたり増幅させた。得られたPCR産物をゲル電気泳動により単離したのち精製したものを、TOPOベクターにサブクローニングした後にシーケンスを解析して全塩基配列がPLCζ遺伝子として正しいことを確認した。このPLCζ遺伝子を制限酵素で切り出して、GFPまたはYFP遺伝子を含むベクターに融合蛋白を発現するようにサブクローニングした。PLCζ遺伝子+GFPまたはPLCζ遺伝子+YFPを制限酵素で切り出して、サイトメガロウィルスのエンハンサーとchickenのβ-actin プロモーターを含むpCAGベクターに組み込んで、融合蛋白の発現ベクターを作成した。また、コントロールとしてGFPまたはYFP遺伝子のみを発現するベクターも作成しておいた。 HEK293細胞に燐酸カルシウムを用いて前述の融合蛋白発現ベクターを遺伝子導入した。融合蛋白を正しく発現することを確かめるために、48時間の培養の後にHEK293細胞から淡白を抽出した、ウェスタンブロット法により合成された蛋白が、予想される分子量と一致することを確認した。 In vivoで融合蛋白発現ベクターの遺伝子導入を行うには、大量のベクターが必要であるため、上記で作成したベクターを、TOP10細胞をcompetent cellとして十分な量が得られるまで増幅しておいた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 正しく融合蛋白を発現するベクターの作成に時間がかかったため。また、大量のベクターを作成する必要があり、ベクターの増幅にも時間がかかった。
Strategy for Future Research Activity	若干の遅れはあるが、概ね想定の範囲内で進行している。予定通り、in vivoでの遺伝子導入を行い、transgenic spermを作成する。効率良くtransgenic spermを作成するための条件設定については十分な検討が必要である。