2016 Fiscal Year Research-status Report
アンドロゲンシグナルの破綻が導く尿道下裂発症分子メカニズムの解明
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15K10647
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| Research Institution | Wakayama Medical University |
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Principal Investigator |
鈴木 堅太郎 和歌山県立医科大学, 先端医学研究所, 講師 (20404345)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 性差 / アンドロゲン / Mafb / 尿道形成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、尿道形成に不可欠なMafb 遺伝子のノックアウトマウスの解析および次世代シーケンサーによる組織ChIP-Seq解析を駆使し、アンドロゲンによる外生殖器雄性化の分子メカニズム、さらに、アンドロゲンシグナルの破綻が導く尿道下裂の発症メカニズムを統合的に理解することを目的としている。
雄有意なMafbの発現がエピジェネティックに制御されている可能性を検証するため、エンハンサーをマークすることができるH3K27Acや転写が抑制されている領域をマークすることができるH3K27Me3などの各種ヒストン抗体を用いてChIP（免疫沈降）を行った。その後、ライブラリーを作成し、次世代シーケンサー解析により、アンドロゲンによりMafb の発現が誘導されるステージのエピゲノムステータスを網羅的に調べた。さらに、新規アンドロゲンの標的遺伝子を同定するためAR抗体を用いて同様の実験を行った。その結果、それぞれの性特異的にH3K27Acでマークされる領域を見出し、Mafbの発現制御領域においても数カ所、雄特異的に転写が活性化されている領域があった。この雄特異的に活性化されている領域の配列を詳しく調べると、器官形成に不可欠な制御因子の結合サイトが存在することがわかった。
AR抗体を用いたChIP-Seq解析から、Mafbに加え新たなアンドロゲン標的候補遺伝子を見出した。リアルタイムPCRによるバリデーションの結果、細胞周期や細胞増殖に関わる因子が尿道形成過程において、アンドロゲンの標的因子として機能している可能性を見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
マウス胎仔の外生殖器原器の組織を用いて、AR抗体によるChIP-seq解析の結果、外生殖器形成過程において新たなアンドロゲンの標的遺伝子を見い出すことができた。Mafbを含むアンドロゲンの標的遺伝子の遺伝子発現制御領域においてアンドロゲンレセプターが結合するAndrogen Responsive Element (ARE)に加え、共通して存在する配列が存在し、その配列に結合可能な転写因子があることがわかった。さらに、各種ヒストン抗体を用いてエピゲノムステータスを調べたところ、それぞれの性特異的にクロマチンがアクティブな状態になっている領域を同定した。
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| Strategy for Future Research Activity |
アンドロゲンによるMafbの発現制御において、AR以外にもその発現を制御し得る候補遺伝子群を同定した。これらの候補遺伝子についてレポーターアッセイにより、Mafbの発現制御に与える影響を調べる。さらにアンドロゲンシグナルとの協調作用があるかも検討する。
Mafbの尿道形成過程における機能を明らかにするため、Mafb KOマウスを用いて、細胞増殖をEdUの取り込み実験、細胞死をTUNEL法により調べる。細胞極性の変化は、ゴルジマトリクスタンパクであるGM130の免疫染色により調べる。さらに、Mafb KOマウスとMafbヘテロマウスにおける遺伝子発現プロファイルをRNA-Seqにより解析することで、Mafbの標的遺伝子群の同定を目指す。
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| Causes of Carryover |
Mafbの下流遺伝子を同定するため、RNA-seq解析を行う予定であったが今年度内の実施に至らなかったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
RNA-seq解析を行うためのライブラリー作成キットなどを購入する。
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