2015 Fiscal Year Research-status Report
子宮頸癌で低下する新規癌抑制分子Crystallinに対する分子標的治療の開発
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15K10719
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
末岡 幸太郎 山口大学, 医学部附属病院, 准教授 (40452643)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | スフェロイド形成能 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
目的：我々はこれまでに子宮頸部扁平上皮癌組織において、癌で発現が減弱する蛋白としてCrystallin (CRYAB) を同定した。さらに免疫組織染色で前癌状態から癌化へ向かう過程で、CRYABの発現が低下して行くことを見出しており、これらのことから癌抑制分子である可能性を考えている。そこでまずCRYABの in vitroにおける機能解析を行うこととした。
方法：子宮頸部扁平上皮細胞癌細胞株SKG-II細胞に、CRYABのcDNAを組み込んだプラスミドを導入し、高発現細胞株を作成した。機能解析として①MTTアッセイによる細胞増殖能の評価、②スクラッチアッセイによる細胞遊走能の評価、③ゼラチンザイモグラフィーによるマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）分泌能の評価、④インベージョンアッセイによる細胞浸潤能の評価、⑤スフェロイド形成能の評価、を行った。
結果：①増殖能はMock、高発現細胞3株を用いて、培養3日目、5日目のMTT吸光度を測定した結果は、上記の細胞間での増殖能の差は認めなかった。②遊走能はプレートにスクラッチでできた間隙の距離を、24時間培養後に計測し、Mock、高発現細胞3株の間で、有意な差は認めなかった。③Mock、高発現細胞3株の培養3日目の培養上清を回収し、ゼラチンザイモグラフィーに供し、proMMP-2、MMP-2の発現量を比較したが、特に差異を認めなかった。④浸潤能はMock、高発現細胞3株を用いて、マトリゲルコーティングのチャンバーを通過した細胞の割合を24時間後に計測したが、各細胞間で有意な差は認めなかった。⑤スフェロイド形成能はスフェロイド形成用の培地で3日間培養した後に、形成率＝スフェロイド数／全細胞数として計算した。高発現細胞3株はいずれもMockと比して有意にスフェロイド形成能が低下していた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
実験手技はこれまでの経験から既に確立しているが、結果が予想に反したものが出ている。我々の仮説ではCRYABは癌抑制分子として働いており、高発現の状態では悪性度の低下、すなわち増殖能、遊走能、浸潤能などは全て減弱することを予想していたが、結果はいずれもコントロールに比して、何も差が無いという結果である。唯一スフェロイド形成能はCRYAB高発現細胞株で低下しており、予想と合致した結果となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの検討でポジティブデータとして結果が得られたのは、CRYABの高発現細胞で、その形成能が低下するという結果のみである。スフェロイド形成は癌幹細胞で形成能が増強することが知られており、CRYABが癌幹細胞の性質に関わること、また発現増強によりスフェロイド形成能が低下することは、癌抑制分子としての機能を有することを示唆するものであると考える。
今後は細胞株の遺伝子導入を含めて、安定細胞株の樹立から再度施行し、また発現抑制細胞株を樹立し、更なる検討に供する。癌細胞の機能解析に関する実験は再施行することとし、さらに癌幹細胞の性質に関する研究（癌幹細胞マーカーを用いた免疫染色やフローサイトメトリー）を検討したい。
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| Causes of Carryover |
これまでの成果は予備実験を施行した際に用いていた試薬等の、残っていたものを使用したため。今後は実験の成果が予想と反したものになったため、最初から再度実験を構築し直すため、新規の試薬購入等が必要になると思われる。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
細胞株購入、遺伝子導入のための分子生物学的手法のための試薬、培養用試薬、ウェスタンブロッティング用試薬、抗体など購入予定。
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