2016 Fiscal Year Research-status Report

卵巣癌における膜型エストロゲン受容体GPR30を標的としたEMT現象の制御

Research Project

Project/Area Number	15K10738
Research Institution	Osaka Medical College
Principal Investigator	藤原聡枝大阪医科大学, 医学部, 助教 (90707960)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	林正美大阪医科大学, 医学部, 講師 (00551748) 大道正英大阪医科大学, 医学部, 教授 (10283764) 田中良道大阪医科大学, 医学部, 講師 (10625502) 金村昌徳大阪医科大学, 医学部, 非常勤講師 (40298782) 恒遠啓示大阪医科大学, 医学部, 講師 (70388255) 田辺晃子大阪医科大学, 医学部, 非常勤講師 (70454543) 佐々木浩大阪医科大学, 医学部, 講師 (80432491) 寺井義人大阪医科大学, 医学部, 准教授 (90278531)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2018-03-31
Keywords	GPR30 / 卵巣癌
Outline of Annual Research Achievements	卵巣癌における播種・転移の過程に関わっている可能性が示唆されるエストロゲン受容体GPE30の機能解析について研究を行っている。現在GPR30の発現ベクターを作成しGPR30を強制発現させた卵巣癌白金製剤感受性株(A2780)および白金製剤耐性株(CaOV-3、A2780CP)を用い、GPR30陽性細胞と陰性細胞を作成した。GPR30の選択的アゴニストを用いてGPR30を刺激しPCR法でEMTに関与する遺伝(Snail、Slug、E-cadherine)のRNAレベルでの変化を確認した。また3D培養を行い、GPR30陽性細胞は形態変化を起こし細胞集塊を形成することを確認した。今後はさらにGPR30の発現によりEMT関連蛋白の発現、細胞形態の変化、浸潤能、増殖能、薬剤耐性の変化、細胞周期への影響の検討を行う予定である。GPR30の選択的アゴニストによる刺激を行い、EMTに関わる遺伝子（Snail、Slug、E-cadherine、AE1/AE3、N-cadherine、Vimentin）、また接着分子(integrin、ICAM-1など)およびMMPsの発現status の解析を行う。さらにMTS assay、invasion assayを行い、それぞれの細胞集団の増殖能、浸潤能を解析する。また、抗がん剤を添加しその奏功性や薬剤耐性への影響について解析する。またGPR30強制発現により細胞周期への影響を調べ、同時に抗がん剤への感受性の変化について検討を行う。次に、卵巣癌細胞株を用いたGPR30のGPR30siRNAアデノウイルスベクターを作成し、卵巣癌細胞株に導入し細胞形態の変化および浸潤能、増殖能、薬剤耐性性、細胞周期およびEMTに関わる遺伝子の発現変化についてin vitroで調べ、GPR30siRNAによる卵巣癌のEMTの制御が可能か否かを調べることを予定している。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 現在GPR30の発現によりEMT関連蛋白の発現、細胞形態の変化、浸潤能、増殖能、薬剤耐性の変化、細胞周期への影響の検討を行っているが、in vitroの条件下で仮定していた実験結果と異なる結果が得られている。 GPR30強制発現後の細胞形態の変化後、足場を失った細胞がアポトーシスに陥っている可能性があり、細胞変化の原因が播種の一過程であるのか、細胞死であるのか再度考察する必要があると考えている。その証明のため、現在MTS assay等を用いて、細胞活性について検討を行っている。
Strategy for Future Research Activity	実験結果が仮定と相違を認めるのは、実験手技による問題もあり、同時に元来計画していた実験計画にのっとっての研究も進めている。細胞形態の変化が細胞死によって起こっているのであれば、GPR30の機能は転移・播種ではなく細胞死に関わる因子として検討項目を変更していくこととしている。