2015 Fiscal Year Research-status Report
色素性乾皮症患者由来iPS細胞を用いた感音性難聴発症機構の解析と疾患モデルの開発
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15K10748
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
大西 弘恵 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 特定研究員 (50397634)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
北尻 真一郎 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 特定病院助教 (00532970)
中川 隆之 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (50335270)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 分化誘導 / 神経細胞 / シナプス形成 / 内耳感覚上皮組織培養 / 共培養 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成27年度の研究計画は、XPA患者由来iPS細胞を用いた聴神経変性メカニズムの解析と聴神経変性モデルの作製である。この目的の為、産業技術総合研究所よりXPA患者由来iPS細胞及びコントロール細胞を入手した。入手までに日数を要したため、まずは一般に使用されている201B7株などを用いて神経細胞と内耳感覚上皮細胞共培養系の検討・確立を行った。マウス蝸牛から感覚上皮細胞を採取し組織培養する系を確立し、201B7株由来のneurosphereと共培養を行い、神経細胞が分化でき、なおかつ、有毛細胞が正常に保たれる期間と培地条件について検討を行った。ある条件下で5日間培養した時に、感覚上皮の生存と神経細胞の軸索伸長が確認できた。
XPA患者由来iPS細胞入手後は聴神経への分化誘導について検討した。聴神経はグルタミン酸作動性ニューロンであり、我々が既に確立したヒトiPS細胞からグルタミン酸作動性ニューロンの分化誘導法は、神経幹細胞の時点で細胞増殖と凍結ストックの作製が可能であるため、のちの実験に同じストック由来の神経細胞を用いることができ、毎回iPS細胞から分化誘導したものを用いるより安定した結果が期待できる。そこでXPA患者由来iPS細胞とコントロールiPS細胞からこの分化誘導法を用いて、神経幹細胞、神経細胞への分化誘導を行った。それぞれのマーカーの発現を免疫染色法で検討したところ、神経幹細胞、神経細胞への分化は認められたが、先行文献で用いた株よりも神経細胞への誘導効率が低かった (＜50%)。ヒトiPS細胞の分化誘導においては株間の差が大きいため、ある分化誘導法を用いる際に、試薬の濃度などを検討し、使用する細胞に合うよう調整が必要な場合がある。このため誘導に用いる因子の濃度や処理期間について検討中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
本研究を行うために、産業技術総合研究所からXPA患者由来iPS細胞を供与いただく必要があったが、予想外に先方の倫理審査に時間を要したため、細胞を入手できたのが2015年の12月であった。それに伴い研究計画が大幅に遅れたため、今年使用するはずであった研究費の一部を来年に持ち越した。現在までに、①聴神経変性モデルの作製に用いる神経細胞の分化条件の検討、②シナプス形成を見るための神経－感覚上皮共培養系の確立の2点を行った。①はXPA患者由来iPS細胞に合わせた誘導因子の検討が必要であることが分かったが、誘導効率の違いは10%-20%程度であるため、早期の問題解決が見込めると考えている。②のシナプス形成を見るための神経－感覚上皮共培養系の確立は一般に普及しているヒトiPS細胞株で条件検討ができているため、①の検討が終了すれば②の系も確立できると考えている。後は時間的な問題であるため、来年度以降の進捗次第で研究期間の延長を検討するつもりである。
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| Strategy for Future Research Activity |
XPA患者由来iPS細胞を用いた聴神経変性メカニズムの解析と聴神経変性モデルの作製を引き続き行う。
XPA患者由来iPS細胞から高効率に神経分化できる条件を確立する。さらにグリア細胞への分化誘導も行う。誘導された聴神経の評価をマーカーの発現や内耳感覚上皮とのシナプス形成によって行う。また、XPA由来細胞の性質を残していることを確認する為、UV 照射やシスプラチン等の薬剤に対する感受性について検討する。
次に脳神経系で産生される主な酸素ラジカルの発生剤などをXPA患者iPS細胞由来神経の培養に様々な濃度とタイミングで添加し、聴神経変性モデルの作出を試みる。正常iPS細胞由来神経の培養との結果に差があるものが見つかればそれを神経変性モデルとし、免疫染色法や遺伝子発現解析、タンパク質の挙動などを解析して聴神経変性メカニズムの解析を試みる。同時にこの神経変性モデルを用い、抗酸化物質の添加による効果に関して検討を行う。さらに神経変性モデルを用いて、オリゴヌクレオチドによる治療効果についても検討する。
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| Causes of Carryover |
本研究に用いるXPA患者由来iPS細胞を入手できた時期が遅かったため、計画通りに研究を進めることが困難であった。そのため、初年度に行うべき研究の一部が間に合わなかった。そこでそれらの実験に用いる試薬などを来年に持ち越し、来年度行う。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
XPA患者由来iPS細胞から高効率に神経分化できる条件を確立する。さらにグリア細胞への分化誘導も行う。誘導された聴神経の評価をマーカーの発現や内耳感覚上皮とのシナプス形成によって行う。また、XPA由来細胞の性質を残していることを確認する為、UV 照射やシスプラチン等の薬剤に対する感受性について検討する。
次に脳神経系で産生される主な酸素ラジカルの発生剤などをXPA患者iPS細胞由来神経の培養に様々な濃度とタイミングで添加し、聴神経変性モデルの作出を試みる。正常iPS細胞由来神経の培養との結果に差があるものが見つかればそれを神経変性モデルとし、免疫染色法や遺伝子発現解析、タンパク質の挙動などを解析して聴神経変性メカニズムの解析を試みる。
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Research Products
(1 results)
