2016 Fiscal Year Research-status Report
色素性乾皮症患者由来iPS細胞を用いた感音性難聴発症機構の解析と疾患モデルの開発
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15K10748
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
大西 弘恵 京都大学, 医学研究科, 特定助教 (50397634)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
北尻 真一郎 京都大学, 医学研究科, 特定研究員 (00532970)
中川 隆之 京都大学, 医学研究科, 講師 (50335270)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 疾患特異的iPS細胞 / 分化誘導 / 聴神経 / 内耳感覚上皮組織培養 / 共培養 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成28年度の研究計画は、XPA患者由来iPS細胞を用いた聴神経変性メカニズムの解析と聴神経変性モデルの作製である。昨年度XPA患者由来iPS細胞からグルタミン酸作動性神経への分化誘導が可能であることを確認し、iPS細胞由来神経幹細胞と内耳組織の共培養系の検討を行った。今年度は①「ヒトiPS細胞から聴神経への分化誘導法の検討」と②「iPS細胞由来神経幹細胞とマウス内耳組織の共培養後におけるiPS細胞由来神経細胞の解析」とを行い以下の結果を得た。
昨年度、XPA患者由来iPS細胞からグルタミン酸作動性ニューロンが分化可能であることを確認したが、より生体に近い解析を行うため、iPS細胞から聴神経への分化誘導法の検討を行った。聴神経は外胚葉から分化したプラコードの一部が耳プラコードへ分化し、これが陥入して内耳前駆細胞を含む耳胞を形成し、この内耳前駆細胞の一部が内耳感覚上皮細胞もしくは聴神経へと分化する。我々は以前iPS細胞から内耳有毛細胞への分化誘導を行い内耳前駆細胞への分化誘導法も確立しているため、聴神経の分化誘導へ応用したいと考えているがそのままでは内耳前駆細胞への誘導効率が低く困難が予想された。そこで、他グループからの報告を参考に誘導法の検討を行い50-100倍ほど分化誘導効率を向上させることに成功した。
同時に、昨年度検討したヒトiPS細胞からグルタミン作動性神経への分化誘導法を用いて誘導した神経幹細胞が、内耳組織との共培養後、機能的な神経へ分化するかどうか確認するため蝸牛と同様に有毛細胞を含む内耳組織である前庭組織との共培養を行い、電気生理学的解析と組織学的解析を行った。その結果、iPS細胞由来神経細胞はナトリウムチャネルを発現しており、自然発火を認めた。これらの事からヒトiPS細胞由来神経幹細胞が内耳組織との共培養系内で成熟神経へ分化することが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究を行うために、産業技術総合研究所からXPA患者由来iPS細胞を供与いただく必要があったが、想定外に時間を要し2015年の12月にようやく細胞を入手した。それに伴い研究計画が大幅に遅れたため、昨年度予定していた実験を引き続き行い、①「聴神経への分化誘導法の改良」と②「iPS細胞由来神経幹細胞とマウス内耳組織の共培養系の確認」とを行った。①では誘導前の前培養を検討することにより、細胞の状態をよくするとともにフィーダー細胞の混入を排除し、効率を上げることに成功した。さらに他グループからの報告を参考にBMP pathway, Wnt pathway, FGF pathwayなどの制御による条件検討を重ね内耳前駆細胞の分化誘導効率を大幅向上させることに成功した。この後聴神経への誘導条件の確立を目指す。この検討が終れば誘導法を疾患患者由来iPS細胞に適応して、患者細胞由来聴神経を用いた検討が可能になる。また、②ではiPS細胞由来神経幹細胞と内耳組織の共培養系において、神経幹細胞が神経マーカー及び成熟神経で見られるナトリウムチャネルを発現した成熟神経細胞へと分化可能であることが示唆され、電気生理学的な解析からも電位依存性Naチャネルを保持していることが示唆されている。このように分化誘導後の神経の解析手法の確立も終えることができた。②の検討条件をもとに今後、蝸牛組織と患者由来細胞から成るin vitroモデルの作製が可能になると考えている。後はin vivoモデルを用いた疾患発症条件の検討にかかる時間の問題であるため、来年度の進捗次第で研究期間の延長を検討するつもりである。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在までの進捗をもとにXPA患者由来iPS細胞を用いた聴神経変性モデルの作製を引き続き行い、聴神経変性メカニズムの解析を行う。
今年度確立したヒトiPS細胞から内耳前駆細胞分化誘導法を用いて、XPA患者由来iPS細胞から高効率に聴神経を誘導できる条件を確立する。また、最近他機関から聴神経の分化誘導法が報告されているため、その方法も検討し効率が良ければその方法でXPA患者由来聴神経の分化誘導を行う。誘導された聴神経の評価は免疫染色法やqPCR法、マイクロアレイによるマーカー遺伝子の発現確認によって行う。また、聴神経への分化誘導が確認されれば、今回確立された内耳組織との共培養系での神経細胞評価法を用い、マウス蝸牛細胞との共培養を行った後、免疫染色法と電気生理学的解析などを用いて分化細胞の評価を行う。また、分化した聴神経細胞がXPA由来細胞の性質を残していることを確認する為、UV 照射やシスプラチン等の薬剤に対する感受性について検討する。この検討のコントロールとして遺伝子異常を修復したリバータントを作成する。
上記検討によりXPA患者iPS細胞由来聴神経が誘導されれば、次に脳神経系で産生される主な酸素ラジカルの発生剤などを培養中に様々な濃度とタイミングで添加し、聴神経変性モデルの作出を試みる。リバータントiPS細胞由来聴神経細胞をコントロールとし、この培養との結果に差があるものが見つかればそれを神経変性モデルとし、免疫染色法や遺伝子発現解析、タンパク質の挙動などを解析して聴神経変性メカニズムの解析を試みる。同時にこの神経変性モデルを用い、抗酸化物質の添加による効果に関して検討を行う。さらに神経変性モデルを用いて、オリゴヌクレオチドによる治療効果についても検討する。
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| Causes of Carryover |
昨年度本研究を行うために、産業技術総合研究所からXPA患者由来iPS細胞を供与いただく必要があったが、予想外に先方の倫理審査に時間を要したため、細胞を入手できたのが2015年の12月であった。それに伴い研究計画が大幅に遅れたため、昨年使用するはずであった研究費の一部を来年に持ち越している。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
ほぼ一年間分の遅延があるため、次年度は2年目に行うはずであった分化誘導法確立の続きと組織との共培養条件の検討を行い、疾患状態を再現する条件の検討もおこない、疾患モデルの作出を目指す。さらに進められればこの疾患のメカニズム解析と治療法の探索も行う予定であるが、時間的に難しければもう一年の延長を考えている。
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