2016 Fiscal Year Research-status Report
ストレスによるIP3受容体を介した内耳障害発生のメカニズムの解明
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15K10760
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
長沼 英明 北里大学, 医学部, 教授 (00198342)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
御子柴 克彦 国立研究開発法人理化学研究所, 脳科学総合研究センター, チームリーダー (30051840)
河原 克雅 北里大学, 医学部, 教授 (70134525)
阪上 洋行 北里大学, 医学部, 教授 (90261528)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | IP3受容体type1 / IP3受容体type1KOマウス / Boettcher細胞 / 小胞体ストレス / 蝸牛機能 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１) IP3Rtype1KOマウスの8W齢の聴覚機能の測定：IP3Rtype1ノックアウトマウスの成体（８Ｗ齢）の内耳蝸牛機能について検討し発表した。hetero(-/-)マウスのABR閾値はWT(+/+)のそれに比して有意に上昇した。この結果から、昨年発表したPND13-17daysのhetero(+/-)KOマウスの聴力低下を認めているが、それが成長の遅延に関連した聴力低下の可能性も考えられていたが、成長の遅延に関連した聴力低下でなく、IP3Rtype1(カルシウムイオンチャネル）の分子数の減少に関連した聴力低下であることが確認された。
２) IP3Rtype1KOマウスにおけるBoettcher細胞の光顕レベルの形態：homo(-/-)KOマウスにおいて、Boettcher細胞とClaudius細胞の境界が不明瞭などの形態変化が認められた。Boettcher細胞にはIP3Rtype1が豊富に存在しているため、同細胞の発生に、IP3Rtype1が重要な役割を果たしていることが示唆された。
３）IP3Rtype1KOマウスの蝸牛におけるIP3Rtype1タンパク量の定量：現在実験進行中であり、次年度に研究成果を発表する予定である。内耳蝸牛を使用して行っているが、蝸牛外側壁の骨の処理方法、Western Blotting 法にどの程度のタンパク量が必要かを検討中である。
４）IP3Rtype1KOマウスにおけるBoettcher細胞の電顕レベルの形態：現在実験進行中であり、次年度に研究成果を発表する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度は、研究の進捗はやや遅れていたが、本年度分は、順調に進展した。
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| Strategy for Future Research Activity |
1)IP3 type1 KOマウスの系統維持：理化学研究所、脳科学総合研究センター、発生神経生物研究チームで系統維持されたIP3 type1 KOマウス：KO(+/-)、KO（-/-）マウス(Matsumoto M, Mikoshiba K, et al 1996)の管理・作製。2)内耳への小胞体ストレスの誘導：WT、同KO(+/-)、同KO(-/-)マウスで、小胞体ストレス誘導剤を用いて小胞体ストレスを内耳に誘導する。小胞体ストレスの誘導は、ツニカマイシン５μg/g BWの量を腹腔内に投与することにより行う。投与3日後に灌流固定後、側頭骨を採取し蝸牛外側壁の骨をはずし、浸透固定を行う。小胞体ストレスが誘導された内耳組織で、小胞体ストレス関連抗体(抗XBP１ポリクローナル抗体)を用いた免疫組織化学を行い、検出する。ツニカマイシンで小胞体ストレスが誘導されない場合は他の小胞体ストレス誘導剤(タプシガルジンthapsigarginなど) を使用する。小胞体ストレスの誘導の程度を前述の3群で比較する。3)内耳のIP3R type1の発現量を小胞体ストレス誘導の前後で比較する。：WT、同KO(+/-)、同KO(-/-)マウスを使用。小胞体ストレス誘導剤（ツニカマイシン５μg/g BW）を投与する前、同3日後に内耳組織を採取し、ホモジュネートした組織を用いて行う。定量RT(real time)-PCR法によりm-RNAを定量し、ウエスタンブロッティング法によりタンパク量を(半)定量する。抗体は抗IP3R type1モノクローナル抗体（4C11, 18A10）を使用する。小胞体ストレスが誘導されている状態ではIP3R type1のm-RNA、タンパク量は減少しているものと考えられる。
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| Causes of Carryover |
平成２７年度におい、１）研究協力者の確保が困難であったこと、また２）IP3受容体KOマウスにおける聴力障害に関する研究で、ABRの測定が予想に反して困難で、得られた結果の信頼性の確認に時間を要したため、研究がやや遅れた。平成２８年度、平成２７年度の研究の遅れを取り戻すまでは至っていないが、平成２８年度の１年間に進む実験量としては、順調に進んだ。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
以下の実験を予定しており、研究費は順調に使用できるものと考えている。
1)IP3type1KOマウスの系統維持:理化学研究所、脳科学総合研究センター、発生神経生物研究チームで系統維持されたIP3type1KOマウス：KO(+/-),KO（-/-）マウスの管理。2)内耳への小胞体ストレスの誘導:WT,KO(+/-),KO(-/-)マウスで、小胞体ストレス誘導剤を用いて小胞体ストレスを内耳に誘導する。小胞体ストレス関連抗体(抗XBP１ポリクローナル抗体)を用いた免疫組織化学を行い、検出する。小胞体ストレスの誘導の程度を前述の3群で比較する。3)内耳のIP3R type1の発現量を小胞体ストレス誘導の前後で比較する。WT,KO(+/-),KO(-/-)マウスを使用。定量RT(real time)-PCR法によりm-RNAを定量し、ウエスタンブロッティング法によりタンパク量を(半)定量する。
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