2017 Fiscal Year Research-status Report

ストレスによるIP3受容体を介した内耳障害発生のメカニズムの解明

Research Project

Project/Area Number	15K10760
Research Institution	Kitasato University
Principal Investigator	長沼英明北里大学, 医学部, 教授 (00198342)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	御子柴克彦国立研究開発法人理化学研究所, 脳科学総合研究センター, チームリーダー (30051840) 河原克雅北里大学, 医学部, 名誉教授 (70134525) 阪上洋行北里大学, 医学部, 教授 (90261528)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2019-03-31
Keywords	IP3受容体type1 / IP3受容体type1KOマウス / Boettcher細胞 / 小胞体ストレス / 聴覚
Outline of Annual Research Achievements	1) IP3Rtype1KOマウスの蝸牛におけるIP3Rtype1タンパク量の定量：Western Blotting法(WB)によるIP3R1のタンパクの半定量を行った。13-17 日齢の同KOマウス（理化学研究所、脳科学総合研究センター、発生神経生物研究チームより供与）、WT (+/+), hetero (+/-), homo (-/-)の各群を使用。左右の蝸牛を摘出後、タンパクを抽出し-30℃で凍結保存。1匹分左右2耳・総タンパク量5μg/wellに調整しSDS-PAGE電気泳動・転写。1次抗体は抗IP3受容体type1 Rat抗体(モノクローナル)：4C11(同施設より供与)を使用。増強化学発光させ解析した。実験１：homo (-/-)では陽性反応が全く認められなかった。実験２：WT (+/+)とhetero (+/-)の比較ではhetero (+/-)でIP3Rtype1のタンパク量は有意に減少していることが確認された。 2）IP3Rtype1KOマウスの聴覚に対するArg-Vasopressinの影響：IP3受容体type1 WT(+/+)、IP3受容体type1KO hetero(+/-)にAVPを腹腔内に投与し、1時間後にABR閾値を測定した。その結果、IP3受容体type1KO hetero(+/-)マウスではAVPの投与で有意に聴力は低下することが確認された。このことから、IP3受容体type1が、聴覚機能において重要な役割を果たしていることが示唆された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 平成２７年度においての研究の進捗はやや遅れていたが、平成２８年度、２９年度は、研究は順調に進展した。
Strategy for Future Research Activity	1)IP3type1 KOマウスの系統維持：理化学研究所、脳科学総合研究センター、発生神経生物研究チームで系統維持されたIP3 type1 KOマウス：KO(+/-)、KO（-/-）マウス(Matsumoto M, Mikoshiba K, et al 1996)の管理・作製。 2)内耳への小胞体ストレスの誘導：WT、同KO(+/-)、同KO(-/-)マウスで、小胞体ストレス誘導剤を用いて小胞体ストレスを内耳に誘導する。小胞体ストレスの誘導は、ツニカマイシン５μg/g BWの量を腹腔内に投与することにより行う。投与3日後に灌流固定後、側頭骨を採取し蝸牛外側壁の骨をはずし、浸透固定を行う。小胞体ストレスが誘導された内耳組織で、小胞体ストレス関連抗体(抗XBP１ポリクローナル抗体)を用いた免疫組織化学を行い、検出する。ツニカマイシンで小胞体ストレスが誘導されない場合は他の小胞体ストレス誘導剤(タプシガルジンthapsigarginなど) を使用する。小胞体ストレスの誘導の程度を前述の3群で比較する。 3)内耳のIP3R type1の発現量を小胞体ストレス誘導の前後で比較する。：WT、同KO(+/-)、同KO(-/-)マウスを使用。小胞体ストレス誘導剤（ツニカマイシン５μg/g BW）を投与する前、同3日後に内耳組織を採取し、ホモジュネートした組織を用いて行う。定量RT(real time)-PCR法によりm-RNAを定量し、ウエスタンブロッティング法によりタンパク量を(半)定量する。抗体は抗IP3R type1モノクローナル抗体（4C11, 18A10）を使用する。小胞体ストレスが誘導されている状態ではIP3R type1のm-RNA、タンパク量は減少しているものと考えられる。
Causes of Carryover	理由：平成２７年度に研究がやや遅れ、全体として研究計画が後ろ倒しになったことから次年度使用額が発生した。平成２８、２９年度は、平成２７年度の研究の遅れを取り戻すまでは至っていないが、平成２９年度の１年間に進む実験量としては、順調に進んだ。使用計画：今後の推進方策を実現するため、１）IP3type1KOマウスの系統維持・管理のための支出、小胞体ストレス誘導剤、小胞体ストレス関連抗体(抗XBP１ポリクローナル抗体)、免疫組織化学、定量RT(real time)-PCR法、ウエスタンブロッティング法などの試薬を購入予定である。2)平成３０年度は、本課題の最終年度になり、研究の進捗状態により、研究結果の報告として、論文にまとめ始めることが想定される。そのためのデータ整理のための支出、英文校正費、論文投稿費等の支出が生じるものと考えられる。