汎用性のある内耳特異的ノックアウトマウス作製法の開発

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K10765
• Research Institution: Jikei University School of Medicine
• Principal Investigator: 櫻井 結華 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助教 (50307427)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 原 央子 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助教 (40528452)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 先天性難聴 / コンディショナルノックアウト / CRISPR/ Cas9

Outline of Annual Research Achievements

先天性難聴の病態解析には動物モデルの作製が不可欠であるが、先天性難聴の原因遺伝子のノックアウトマウスの一部は胎生致死となるため生後の聴覚生理を解析できないという問題がある。DiGeorge症候群やWaardenburg症候群などの症候群性難聴のヒト疾患モデルマウスの多くは、内耳以外の発生異常が原因で発生中または出生直後に致死となり、生後の聴覚生理機能を評価することは不可能である。こうした問題を解決するため、内耳特異的コンディショナルノックアウトマウスを、汎用性のある方法で作製する事を目的として研究を行っている。
我々はこれまでにSix1遺伝子のシスエレメントの解析により内耳発生領域に特異的に発現を示すエンハンサー領域を発見した。このエンハンサー領域の制御下にCreリコンビナーゼを発現するCreマウスを作製し、任意の難聴原因遺伝子をloxP配列で挟んだノックインマウスも作製する事で、内耳特異的コンディショナルノックアウトマウスの作製が可能となり、現在進めている。
また、従来行われているES細胞の遺伝子改変を経て作製するノックアウトマウスは作製までに多くの労力と時間を要する。そこで、近年遺伝子改変技術に大きな進歩をもたらしたCRISPR/Cas9システムを用いて、簡便にノックインマウス作製を行う技術の開発も進めている。CRISPR/Cas9システムは任意の配列に設定したgRNAを認識してCas9タンパクがゲノムDNAを切断し、切断部位の両端の配列をアームとして有したssDNAを同時に注入することで遺伝子ノックインを行うことができるもので、これまでに行われてきたノックイン作製と比較して圧倒的に短時間低コストでノックインを行うことが可能である。本実験系が確立されることにより理論的に全ての難聴原因遺伝子の解析が可能となる。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

作製したマウス（Six1内耳特異的エンハンサーの制御下にCreERを発現するマウス）の解析を継続して行った。トランスジェニックマウスのバックグラウンドとしてC57BL/6マウスを選択したが、トランスジーンのジャームライントランスミッションを確認できた産仔が想定よりも少なく、3ラインのみとなった。内耳発生領域での発現が最も強いラインをレポーターマウスと交配することで確認中である。CreER発現マウスでは、タモキシフェンの投与量やタイミングによりCreの発現領域をコントロールすることが可能であるが、条件を最適化するための検討項目が多く進捗の遅れにつながっている状況である。また、ノックインマウスの作製に関して、当初受精卵へのgRNAとCas9発現プラスミドのマイクロインジェクションを予定していたが、エレクトロポレーションを用いた簡便で効率の良い方法が報告されたため、gRNAとCas9の受精卵への導入方法を変更して研究を進めている。同方法では長いDNA配列のノックインは困難であるが、本研究で用いる配列は30-40bpと短いため効率的な方法と考えている。エレクトロポレーターのプロトコールや、電極に関しては最適化を終えた。これら最適化等の作業を綿密に行っている関係で計画がやや遅れている状況である。

Strategy for Future Research Activity

内耳特異的Creマウスの発現解析を引き続き進める。Six1エンハンサー以外の候補として、文献的検索によりSox2とSox3にも同様に内耳特異的な活性を持つ領域が示されていたため、同エンハンサーを用いたCreマウスの作製を行った結果、トランスジーンのジャームライントランスミッションを確認できた産仔がそれぞれ2ライン得られたため、これらの解析も進めていく。

Causes of Carryover

研究を遂行する中で、平成29年度に新規内耳特異的Creマウスの作製の必要性が生じる可能性を考慮し、平成28年度研究においてなるべく物品購入を切り詰め、余剰なマウス交配も控え、平成29年度に使用できる金額を残すようにしたため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

平成28年度の残金と平成29年度予算を合わせて研究を進めていく。まず、内耳に最も強い発現をもつマウスラインの選定を引き続き進めていくために、これらのマウス交配・飼育・解析にかかる費用に充てる。また、Six1、Sox2、Sox3のエンハンサーを使用したCreマウスを作製したが、さらに追加のラインを作製する必要性も検討中であり、その費用にあてる可能性もある。