汎用性のある内耳特異的ノックアウトマウス作製法の開発

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K10765
• Research Institution: Jikei University School of Medicine
• Principal Investigator: 櫻井 結華 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助教 (50307427)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 原 央子 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助教 (40528452)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 先天性難聴 / コンディショナルノックアウト / CRISPR/ Cas9

Outline of Annual Research Achievements

先天性難聴の病態解析には動物モデルの作製が不可欠であるが、先天性難聴の原因遺伝子のノックアウトマウスの一部は、胎生致死となり生後の聴覚生理を解析できないという問題がある。DiGeorge症候群（Tbx1遺伝子変異により難聴と心疾患を合併）やWaardenburg症候群（Sox10遺伝子変異により難聴と巨大結腸症を合併）など、症候群性難聴のヒト疾患モデルマウスの多くは、内耳以外の発生異常が原因で発生中、あるいは、出生直後に致死となり、生後の聴覚生理機能を評価することは不可能である。こうした問題を解決するため、内耳特異的コンディショナルノックアウトマウスを作製する事を想起した。申請者はこれまでにSix1遺伝子のシスエレメントの解析により内耳発生領域に特異的に発現を示すエンハンサー領域を発見した。同エンハンサー領域の制御下にCreリコンビナーゼを発現するCreマウスを作製し、任意の難聴原因遺伝子をloxP配列で挟んだノックインマウスを別途作製する事で、内耳特異的コンディショナルノックアウトマウスの作製が可能となる。これまでの、ES細胞の遺伝子改変を経て作製するノックアウトマウスは作製までに多くの労力と時間を要する。そこで、近年遺伝子改変技術に大きな進歩をもたらしたCRISPR/Cas9システムを用いて、簡便にノックインマウス作製を行う事とした。CRISPR/Cas9システムは任意の配列に設定したgRNAを認識してCas9タンパクがゲノムDNAを切断する。その際に、切断部位の両端の配列をアームとして有したssDNAを同時に注入することで遺伝子ノックインを行うことができる。これまでに行われてきたノックイン作製と比較して圧倒的に短時間低コストでノックインを行うことが可能である。本実験系が確立されることにより理論的に全ての難聴原因遺伝子の解析が可能となる。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

外部委託により作製した、Six1内耳特異的エンハンサーの制御下にCreERを発現するマウスの解析を継続して行った。トランスジェニックマウスのバックグラウンドとしてC57BL/6マウスを選択した（既存の難聴原因遺伝子のFloxマウスにC57BL/6をバックグラウンドとして作製された系統がいるため）ことにより、トランスジーンのジャームライントランスミッションを確認できた産仔が想定よりも少なく、3ラインのみとなった。文献的検索によりSox2とSox3にも同様に内耳特異的な活性を持つ領域が示されていたため、同エンハンサーを用いたCreマウスの作製も行った。トランスジーンのジャームライントランスミッションを確認できた産仔がそれぞれ2ライン得られ、並行して解析を進めた。タモキシフェンの投与量決定に多くの検討を要したが、1ラインにおいて内耳発生領域で発現を示すラインの選定に成功した。
一方、内耳特異的エンハンサーを用いて、直接CRISPR/Cas9システムを作動させる方法の開発にも取り組んできた。ウイルスベクターを用いて、内耳特異的エンハンサーの制御下にCas9を発現させ、gRNAは任意の遺伝子配列を設定することで、汎用性の高い実験系となり得る。予備実験として行ったレポーター遺伝子発現細胞へのウイルス投与実験では、良好なノックアウト効率を確認できた。

Strategy for Future Research Activity

選定した内耳特異的Creマウスと既存のFloxマウスとの交配により、内耳発生異常が再現されるかを確認する。マウスの聴力測定方法としてはauditory brainstem responseとotoacoustic emissionの最適化を終えている。
また、ウイルスベクターを用いたCRISPR/Cas9システム導入に関しては、in vivo実験へと移行していく。受精卵あるいは胎仔への暴露を予定している。

Causes of Carryover

理由：新規内耳特異的Creマウスの作製に加え、実現可能性の高いウイルスベクターを用いたCRISPR/Cas9システムの応用というテーマにも取り組んでいるため、期間の延長及び次年度使用資金を申請した。

使用計画：当該金額を使用し実験を進めていく。具体的な平成30年度の予定は以下の通りである。内耳特異的CreマウスラインをFloxマウスと交配しその内耳発生を観察する。これらマウス交配・飼育にかかる費用に充てる。また、ウイルスベクターのin vivo実験に伴う妊娠マウスやウイルスの購入費用として使用する予定である。