2016 Fiscal Year Research-status Report
内耳侵害受容体仮説に基づいた片頭痛関連めまいの病態解明のための基礎的研究
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15K10772
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| Research Institution | 独立行政法人国立病院機構(東京医療センター臨床研究センター) |
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Principal Investigator |
五島 史行 独立行政法人国立病院機構(東京医療センター臨床研究センター), 平衡覚障害研究室, 室長 (80286567)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
北原 糺 奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (30343255)
鳥海 春樹 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師(非常勤) (30528203)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 片頭痛 / 細胞死 / 疼痛刺激 / エクソソーム / microRNA let-7b / TLR7 / TRPA1 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
内耳培養細胞HEI-OC1を痛みストレス誘導剤でありTRPV1のリガンドであるカプサイシンで処理した際の細胞生存率は濃度依存性に低下するが、時間依存性には低下せず当初計画とは異なっていた。そのため、細胞死と疼痛刺激を同時に誘導する可能性を持つmicroRNA let-7bとそのレセプターであるToll-like-Receptor 7(TLR7)とTransient Receptor Potential Ankyrin (TRPA1)の内耳感覚細胞における機能評価を行った。その結果、micoRNA let-7bを遺伝子導入した細胞と直接投与した細胞は、時間依存性・濃度依存性に細胞生存率が低下することを確認した。また、細胞疼痛刺激マーカーとして用いたp-ERKの発現も、micoRNA let-7b遺伝子導入細胞と直接投与細胞ともに有意な発現増加を認めた。さらに、micoRNA let-7bのレセプターでもあるTLR7と、TLR7とリンクして機能するTRPA1 の発現はmicoRNA let-7b遺伝子導入細胞と直接投与細胞ともに有意な発現増加を認めた。この結果は、エクソソームに含有されたmicoRNA let-7bは、TLR7とTRPA1を介して細胞内へ移行し、内耳感覚細胞の細胞死制御と疼痛刺激ともに深く関与することを示唆する。その他の実験からmicroRNA let-7bはオートファジー誘導とも深く関与すること、内耳感覚細胞において、TLR7はアポトーシス誘導による細胞死シグナルに深く関与することを示した。さらにmicroRNA let-7b inhibitorがTLR7に対するantagonistとして、内耳感覚細胞のアポトーシスを制御する可能性も示すことができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
前述したように、内耳培養細胞HEI-OC1に対する疼痛刺激法の変更を余儀なくされた。しかし、microRNA let-7bを内耳感覚細胞に投与した際に、microRNA let-7bは培養液中ではエクソソームに含有され、細胞外からTLR7を介した細胞死シグナル伝達経路を活性化すること、さらにはTLR7にリンクするTRPA1を介した疼痛シグナル伝達経路も活性化する可能性を示唆する結果を得た。また、TLR7agonistはアポトーシスを誘導したこと、microRNA let-7b inhibitorがTLR7 antagonistとして内耳感覚細胞のアポトーシスを抑制したことは、内耳における細胞死制御を基盤とした新規治療を開発する上で、今後の研究推進に大きな意味を持たせると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
microRNA let-7bが培養液中ではエクソソームに含有され、細胞外から細胞内にTLR7を介して刺激を加え細胞死制御を行うこと、TLR7にリンクするTRPA1の刺激を介して内耳感覚細胞内に疼痛刺激を加えることを形態と機能の両面から検討する。まず、TLR7とTRPA1の直接的な作用を検討するため、HEI-OC1細胞をmicroRNA let-7b導入細胞、microRNA let-7b inhibitor 導入細胞、microRNA let-7b処理細胞、microRNA let-7b inhibitor処理細胞を準備する。さらに、TLR7 Knock Down細胞、TRPA1 Knock Down細胞を準備する。形態については、各細胞について、１．TEMによる細胞内超微細構造の観察、２．TEMによるエクソソームに含有されたmicroRNA let-7bの形態観察を行う。機能面では、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、microRNA let-7b処理細胞でのエンドソームに含有されたmicroRNA let-7bの局在、TLR7とTRPA1の細胞内局在を各細胞について検討する。これらの変化を定量化するために、核タンパク質、細胞質タンパク質、膜タンパク質の抽出を行い、microRNA let-7bがTLR7とTRPA1を介して与える内耳感覚細胞の核内・細胞質内、細胞膜の変化をwestern blot法により定量化する。さらには、TLR7とTRPA1の直接的影響を観察するために、準備した各細胞でのTLR7とTRPA1の免疫沈降を行う。
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| Causes of Carryover |
内耳培養細胞HEI-OC1を痛みストレス誘導剤でありTRPV1のリガンドであるカプサイシンで処理した際の細胞生存率は濃度依存性に低下するが、時間依存性には低下しないことを確認し、TRPV1の発現、細胞痛み刺激マーカーp-ERKの発現では、変化はするものの有意差は認めないという当初計画とは異なる結果を得たため、内耳に対する痛み伝達刺激における詳細を再検討する必要がでてきたことが理由である。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
試薬費（microRNA導入キット 10200円x2、microRNA let-7b 52000円x2、let-7bインヒビター 53000円x2、核タンパク質・細胞質タンパク質抽出キット 62000円x2、細胞膜タンパク質抽出キット53000円x2、Western blot 試薬:80000円x3、免疫沈降試薬53000円x2）、抗体費（TLR7 49000円x2、TRPA1 54000円x2）、siRNA (Control siRNA 54000円x2、TLR7 siRNA 58000円x2、TRPA1 siRNA 58000円x2)の購入を必要とする。さらに、本研究の成果を国内外に示すために、国内、国外への渡航費用として使用する予定である。
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