2016 Fiscal Year Research-status Report
蝸牛神経低形成の新規原因候補ZBTB10の内耳発生における機能解析
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15K10773
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| Research Institution | 独立行政法人国立病院機構(東京医療センター臨床研究センター) |
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Principal Investigator |
務台 英樹 独立行政法人国立病院機構(東京医療センター臨床研究センター), その他部局等, 研究員 (60415891)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
難波 一徳 独立行政法人国立病院機構(東京医療センター臨床研究センター), その他部局等, 研究員 (60425684)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 内耳奇形 / 難聴遺伝子 / 神経芽腫細胞 / ゲノム編集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
内耳奇形を伴う難聴のほとんどは原因不明である。研究代表者らは蝸牛神経低形成を伴う難聴患者において、エクソーム解析により新規の難聴原因候補遺伝子ZBTB10を同定し、これが蝸牛神経細胞で発現していることを確認している。本研究は、ZBTB10の内耳形態形成における役割を解析することを目的とする。平成28年度は、I：平成27年度に引き続き神経突起伸長中の神経細胞に対して本遺伝子の機能解析実験をおこなった。また、II：平成27年度にゲノム編集技術を用いて作成したZbtb10変異マウスの表現型解析をおこなった。
I：神経細胞に対するZBTB10の機能解析実験 神経芽腫細胞NB-1は、cAMP刺激により神経突起伸張を起こすが、この時、ZBTB10発現量が上昇する。代表者は昨年度に正常ZBTB10、または難聴患者で検出された変異型ZBTB10を発現し、かつN末端に蛍光タンパク質mCherryを融合タンパク質として発現するベクターを作成し、これをNB-1細胞に導入したが細胞死を誘発し解析不能であった。本年度は発現ベクターのプロモーター部位を改変した系を作成することで、NB-1細胞へ本遺伝子を導入することが可能となった。現在、ZBTB10発現と細胞増殖・分化との関連解析実験を実施中である。
II： Zbtb10変異マウスの表現型解析 CRSPR/Cas9法を用い、難聴患者で検出されたnonsense変異とほぼ同様の位置にフレームシフト変異をヘテロに持つZbtb10mut/+（変異ヘテロ）マウスを作出し、聴力・その他の表現型・内耳形態の解析を実施した。Zbtb10変異ヘテロマウス同士の交配による産仔中に変異ホモマウスが含まれていないため、変異ホモマウスは胎生致死であると考えられた。Zbtb10変異ホモマウスを体外授精により作出する試みを平成29年度に実施し、胎仔の組織化学的解析を実施する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
神経芽腫細胞NB-1に対する遺伝子導入に試行錯誤の結果成功した。現在画像データを取得・解析中であり、進捗状況は順調である。一方Zbtb10変異マウス解析についても、聴力測定は終了し、進捗状況は順調である。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の計画を発展させ、体外授精によりZbtb10変異ホモマウスを作出し、胎生期における同遺伝子の内耳発生における役割を考察する予定である。体外授精は、CRSPR/Cas9法によりZbtb10変異マウスを作成した東京都医学総合研究所・哺乳類遺伝プロジェクト 吉川欣亮博士に依頼する。また、本結果をまとめ論文を投稿し、国内外の学会で発表する計画である。
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| Causes of Carryover |
平成28年度の実験計画における、培養細胞実験における遺伝子導入試薬の変更にともない、試薬消耗品にかかる経費が計画よりも少額となった。また、動物実験における電気穿孔法による胎仔への遺伝子導入の変更にともない、経費が少額となった。さらに、国際学会への発表一回分の旅費を使用しなかった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
本年度は動物実験にかかる試薬、および解析用コンピューターなどを購入する予定である。また、研究成果をまとめ、国際誌への投稿・発表とともに学会等における発表、情報発信を積極的に実施する予定である。
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Research Products
(7 results)
