2015 Fiscal Year Research-status Report
頭頸部癌における低酸素誘導タンパク質の発現と高濃度酸素療法に関する研究
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15K10816
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| Research Institution | University of the Ryukyus |
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Principal Investigator |
真栄田 裕行 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (40264501)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | LOX-1 / 頭頸部癌 / 高濃度酸素療法 / ｐ５３ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
低酸素濃度環境下に誘導される遺伝子、Lysyl Oxidase type-1（以下LOX-1）遺伝子が、頭頸部扁平上皮癌において高頻度に発現し、予後やリンパ節転移の予測因子になり得ることが報告されている。しかしLOX-1の癌増殖あるいは癌抑制における分子レベルでのメカニズム、さらには臨床面においての役割や意義については未だ不明の点が多く残されている。
本研究は最終的にはLOX-1 の臨床応用を目指している。すなわち頭頸部癌に有効な新規治療方法を確立することを最終目標としている。
この目的を達成するための短期目標を、平成27年度はまず分子生化学的手法を用いて、癌細胞におけるLOX-1の役割を解明することとした。次いでLOX-1とP53およびcyclinD1との発現の相関を明らかにし、また各々の関係性の変化が癌細胞に与える影響についての検討を計画した。具体的にはヒトLOX-1のcDNAクローニングを行い、種々の方法で結合タンパク質の探索をすると共に、抗LOX-1抗体を作製してLOX-1の細胞内、あるいは組織内発現や局在を検討することを計画した。実験の進行具合により、LOX-1、P53およびcyclinD1遺伝子を各種細胞系やマウスに組み込んで細胞レベル、あるいは個体レベルでの影響についての研究を計画している。
これらの実験が順調に推移すれば、高酸素濃度環境下におけるLOX-1、P53、cyclinD1の発現とその関係性、癌細胞や担癌個体レベルにおける癌生物学的特質の変化についての関連性が明らかとなり、高濃度酸素環境を利用した新規の頭頸部癌治療の方法を確立させるための指標の獲得に繋がることが期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
平成27年度
1.各種発現ベクターの構築
LOX-1遺伝子のcDNAクローニングおよび抗LOX-1抗体の作製は既に終了した。現在タンパク質発現のためのベクターを順次作製中である。具体的にはクローニングされたLOX-1およびP53、cyclinD1のcDNAを哺乳類発現ベクター系（pcDNA3 等）、大腸菌発現ベクター系（pGEX-6p、pET30 等）、バキュロウイルス発現ベクター系（pFastBac-HT、pBacPAK9 等）、酵母発現ベクター系（pBTM116、pGBT9 等）レトロウイルス発現系（pMX-puro 等）にサブクローニングし、各種の実験に対応したコンストラクトを順次作製，用意している。これらの発現システムはすでに稼働できる状態にあるが、いくつかは現在も作製中である。
2.頭頸部癌組織におけるLOX-1、P53、cyclinD1 の発現解析
作製した抗LOX-1抗体を用いて生検材料、手術検体などの癌組織におけるLOX-1 の発現および細胞内局在や安定性を解析した。また頭頸部以外の癌組織におけるLOX-1 の発現を比較検討した。方法はウエスタン解析法によるティッシュアッセイ、免疫蛍光染色法を用いた。またLOX-1 とP53 およびcyclinD1 の発現およびその相関に関する検討も、同じく手術時に切除、採取した腫瘍検体等を用いて行った。具体的には腫瘍の切除断端におけるLOX-1、P53 およびcyclinD1 の発現について検討した。
平成27年度は当初、in vitro実験を主体とした計画を立てていたが、抗LOX-1抗体が先に完成していたため，病理組織を用いた病理学的検討を先に行うこととした。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成28年度以降は引き続き発現ベクターの構築を継続すると供に、酵母ツーハイブリッド法による基質タンパク質の同定や、LOX-1とその結合タンパク質に関する細胞生物学的解析のための実験を計画している。
これらの実験が順調に遂行されれば、平成29年度以降は頭頸部癌細胞株を用いたLOX-1、P53、cyclinD1 の発現解析や、下記のごとくマウスを用いた個体レベルでの実験を施行する予定である。
LOX-1 遺伝子改変マウスの作製および解析
生化学的もしくは細胞機能上重要と判定されるLOX-1 のトランスジェニックマウスまたはノックアウトマウスを作製し、個体発生における影響を調べる。特にLOX-1 ノックアウトマウスにおける発癌の異常に注目する。その他にもこの遺伝子操作マウスを使用した個体レベルの解析により、既存の発生異常または癌と類似の病理および臨床症状を呈する疾患が存在するかを検索する。
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| Causes of Carryover |
平成27年度購入予定であった大型備品、中型遠心分離機500ｍlボトル用（予算1250000）は，当初酵母を用いたツーハイブリッド実験で使用する予定であったが、研究計画の一部入れ替え（in vivo実験を平成27年度中に施行）に伴い、平成27年度の予算が執行できていない。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
ツーハイブリッド実験は28年度以降に施行する予定につき、平成28年度中に購入予定である。
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