喉頭麻痺に対する線維芽細胞増殖因子を徐放させた自家筋膜移植術の検討

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K10825
• Research Institution: Kitasato University
• Principal Investigator: 永井 浩巳 北里大学, 医学部, 講師 (70237486)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 再生 / 喉頭麻痺 / 塩基性線維芽細胞増殖因子 / Drug delivery system / 自家筋膜移植

Outline of Annual Research Achievements

我々は、組織の支配神経が障害された後に起こる、廃用組織の再生について研究している。喉頭で、神経麻痺がおこると、組織は萎縮し、嗄声や誤嚥のリスクを上げ、患者の生活の質を低下させる。そこで、組織再生に必要な、足場、細胞と調節因子をこの廃用組織に与えることで、再生が起こることを期待し、増殖因子である塩基性線維芽細胞増殖因子を徐放させた自家筋膜移植の治療効果を検討している。神経障害の後に起こる組織変化は、生体内の様々な因子か絡み合って起こっており、in vitroの研究では十分に解明できない。そこで、神経麻痺の動物モデルを作成し、増殖因子を徐放させた自家筋膜移植の治療効果を観察している。平成27年度は、組織学的検討のための検体採取が主な研究となった。上喉頭神経と反回神経の切除は、比較的安定して施行できていたが、麻酔深度が不安定になる症例や、出血の調節が十分できない症例があり、手術後に3例死亡してしまった。このため、麻酔深度の安定化のため、麻酔薬投与後、十分な観察期間を設けることとし、追加の投与量は、初回投与量の8割にした。また、治療例の早期に実験を行ったものは、術後の呼吸状態の悪化などにより、手術後に死亡する症例があった。そこで、手術中、特に喉頭内に移植片を移植する前に、気管切開などの上気道の確保を行うことにした。気管切開孔は、一過性のものであり、手術後は自然閉鎖する症例もあり、実験動物への身体影響は強くないと考える。治療が完遂した症例は、二酸化炭素の吸入で安楽死させてから、喉頭を摘出して、ホルマリンで固定後にパラフィンで包埋する。これを200μm間隔に3μmで薄切して、連続切片を10枚ずつ作成した。薄切に際して、軟骨の骨化が強い症例があり、この場合は蟻酸入りのホルマリンで、組織の軟化を図ってから薄切した。現在、薄切検体の搾取中である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

現在、37匹のラットを用いて、反回神経と上喉頭神経の切断モデルの作成と、喉頭内への移植手術を行っている。すでに、この実験を完遂している症例は15匹で、安楽死後に喉頭を摘出して薄切を行っている。実験の途中で、死亡するラットがあり、すべての症例が、この実験過程を完遂できていない。実験過程での死亡例を無くすため、手術操作について、幾点か改良を試みた。改善点は、麻酔投与の手順の改善と、呼吸状態によっての上気道の確保である。改善後は、多くの症例で支障なく実験を遂行できている。摘出した喉頭は、順次薄切し検体を作成している。ただ、移植症例では、軟骨の骨化があるのか、薄切しにくい。そこで、薄切面の面出し後、蟻酸とホルマリンの混合液に、数十分つけてから薄切している。脱灰時間が短いため、次の薄切を行う場合は、同様の手順を踏む必要があり、時間がかかっている。現在、連続切片の薄切が終了した症例は、7例である。

Strategy for Future Research Activity

実験動物の安定した、侵襲の少ない実験を行っていく。
手術・麻酔の手技は、呼吸状況の悪化に対する対応と麻酔深度の安定化で、安定した実験ができると考える。検体作成においては、脱灰作用に多少時間はかかる可能性はあるが、地道に進行できると考える。
次の実験である神経トレーサーの追跡は、実験動物の移植、および移植後の経過が順調であれば、問題なく行えると考える。ただ、神経トレーサー投与後の開頭など、操作が煩雑な点もあり、多少時間がかかる可能性がある。どうしても1日で行える実験量が制限されるからである。実際に、神経トレーサー追跡実験が始まってからでないと、不明な部分はある。

Causes of Carryover

実験動物の移植実験の安定化に時間がかかり、予定通りに実験が進行しなかった。このため、次年度に繰り越すことになった。ただ、実験手技については、改良点が見いだされ、今後は、安定した実験進行ができると考える。動物実験が、思うように進行しなかったため、検体の採取と染色を、まだ行えていない。次年度は、染色のための試薬等の購入が必要である。

Expenditure Plan for Carryover Budget

現在の予定では、組織学的検討を行う最後の症例は、平成28年3月12日に反回神経と上喉頭神経の切除を行った症例で、順調に経過すれば平成28年10月に完遂する。このように、平成27年度内に予定していた組織検討を行う実験が、すべての症例を年度内に行なうことができなかった。このため、これらの症例の処置、手術及び飼育のための費用を、次年度に計上する。これに伴い、組織採取および染色を次年度に行うことになるので、平成27年度に計上していた、組織染色用キットや一次抗体の購入費用を、次年度に回すことにする。