Spheroidal cultivation of the human limbal epithelial niche from small limbal tissue.

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15K10907
• Research Institution: Tokyo Dental College
• Principal Investigator: 比嘉 一成 東京歯科大学, 歯学部, 助教 (60398782)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 角膜上皮幹細胞 / ニッチ / スフェロイド

Outline of Annual Research Achievements

角膜輪部には角膜上皮の幹細胞が存在し、骨髄幹細胞のように幹細胞を維持する環境であるニッチの存在が考えられる。これまでに１角膜輪部組織から１ヶ月以上培養可能なニッチ様構造を維持したスフェロイドの作成が可能であることを報告してきた。本研究の昨年度においてはこの長期培養が可能なスフェロイドの保存条件を検討するため、研究協力者（兼子）と協力し、短期保存後における角膜輪部上皮増殖能への影響を検討してきた。本年度においては長期保存における影響についても検討した。
方法は昨年度と同様に、１ヶ月間培養したスフェロイドを少量の保存液でも保存可能か検討するため、直接液体窒素が触れることがない２段階容器を用いて保存を行った。短期保存は１週間後、長期保存は昨年保存しておいた１年後のスフェロイドを用いて行った。保存終了したスフェロイドをあらかじめ用意しておいたマイトマイシンC処理した3T3上に播種し、10日から１週間培養を行った。形成した上皮のコロニーはローダミンBにて染色した。
短期保存では昨年度と同様に-80Cならびに液体窒素での保存では増殖能への大きな違いは見られなかったが、１年間の長期保存では-80Cではほとんど増殖が見られなくなっていることがわかってきた。一方、保存液の量による影響も検討したが、大きな違いは観察されなかった。また、本年度においてはスフェロイドの移植法の開発を行うため、ウサギ輪部機能不全モデルを作成し、スフェロイドの移植を行っており、現在移植後の解析を行っているところであり、本研究の成果報告書で報告する予定である。