2015 Fiscal Year Research-status Report
胆道閉鎖症における制御性T細胞のsubpopulation解析
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15K10917
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| Research Institution | Chiba University |
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Principal Investigator |
齋藤 武 千葉大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (20406044)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
幡野 雅彦 千葉大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (20208523)
吉田 英生 千葉大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (60210712)
坂本 明美 千葉大学, バイオメディカル研究センター, 准教授 (90359597)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 胆道閉鎖症 / 制御性T細胞 / 機能解析 / subpopulation / 小児外科学 / 免疫学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成27年度はまず胆道閉鎖症(BA)患児と対照群の末血単核球を用い、一般的制御性T細胞(Treg)とされる細胞表面マーカーがCD4+CD25+であるTリンパ球の出現頻度を測定した。BA群12検体(採取日齢56.3±21.4、術前検体)、対照群10検体(同123.5±75.3、同術前)のそれは各々5.6±3.5%、6.4±4.5%(p=0.56)で有意差を認めなかった。
次いでTreg(CD4+CD25+細胞)を、他の細胞表面マーカーであるCD45RA、CD127およびFoxP3を使ってsubpopulationに分離・抽出した。ある種の自己免疫性疾患ではCD45RA+FoxP3lowがresting状態を、CD45RA-FoxP3highが活性化状態を、そしてCD45RA-FoxP3lowは非Treg細胞とみなすことがある。各subpopulationのBA群と対照群の出現頻度は、BA群・対照群の順に3.4±2.4%・2.6±1.9%(p=0.32)、1.3±2.1%・2.4±3.2%(p=0.04)、2.3±1.7%・2.0±1.8%(p=0.25)であり、活性化状態にあるTregがBA群で有意に低値を示すことが示された。つまり両群は、一般的Tregの総数に有意差は認められないものの、その分画につき検討すると制御機能を有するTreg分画が有意に減少しており、これがBAの病態に関与している可能性が示唆された。
また一般的Treg(CD4+CD25+細胞)を用いてリンパ球増殖抑制試験(CFSE suppression assay)を行い、特定のCFSE減衰(4回分裂)を示したエフェクター細胞の割合(M4、%)を計測した。結果、対照群(日齢6 卵巣嚢腫患児)では平時M4は23%・Treg添加で9%に抑制された。一方BA(Icyst, 日齢4)では平時M4が29%、Treg添加で32%(p=0.02)と有意差を認めなかったが、3倍量のTregを加えるとエフェクター細胞の増殖が軽度抑制(20%)された。これはBA群でTreg機能が低下している可能性を示唆する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成27年度は、患者(BA群と対照群)血液検体からのビーズを用いた末血単核球(PBMC)の分離、各種細胞表面マーカー(CD4,CD25,CD45RA,CD127,FoxP3)を用いたTreg subpopulationの抽出、Treg(CD4+CD25+T細胞)によるリンパ球増殖抑制試験、の各実験手法と系の確立に主眼を置いた。現在末血からの各種Treg(CD45RA+FoxP3low、CD45RA-FoxP3high、CD45RA-FoxP3low)の分離と抽出はほぼ支障なく実施可能となった。一方で各Treg subpopulationの増殖抑制試験では、使用するエフェクター細胞の種類、培養条件と細胞密度に応じ、Tregの抑制効果にバラツキが生じる傾向があることが判明したため、実験の再現性と信頼度を改善すべく実験環境の修正を行っている。一般のTreg(CD4+CD25+T細胞)を用いた増殖抑制試験では同エフェクター細胞のコンディショニングは定型化できているため、本課題はじきにクリアできると予想している。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成28年度は、これまでの実験で分離可能となったCD45RA+FoxP3low、CD45RA-FoxP3high、CD45RA-FoxP3lowのTreg subpopulationを用い、リンパ球増殖抑制実験をさらに進め、再現性と確度を上げてゆく。目下の課題となっているエフェクター細胞の実験環境としては、CD4+CD25+Tregを用いた実験（エフェクター細胞数を3.3×103個とし、2日間培養後抗CD3/CD28 抗体による増殖刺激を1日施行)を参考とし、微調整を行う。
また他のTreg機能評価法として、上記リンパ球増殖抑制実験前後の上清中に含まれるサイトカイン濃度をELISA法とflowcytometryで測定する予定である。着目サイトカインはIL-10、TGF-betaとIFN-gamma(negative factor)を検討している。並行してTreg subpopulationにおける着目サイトカインのmRNA・蛋白発現レベルを確認する予定である。
さらに局所(肝組織)におけるTreg subpopulationとサイトカインの分布と発現強度について検討してゆく。
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| Causes of Carryover |
平成27年度に行った実験にかかる諸費用のうち、主要なものは細胞培養関連とflowcytometryに関するものであった。上記関連物品類と試薬の多くは、研究協力者が所属するバイオメディカル研究センターにストックが存在したため、予想されたほどコストがかからなかった。また平成27年度は予備実験の占める割合が多く、実験条件・環境の詳細を微調整することに腐心しており、検体を用いた集中的な実験は平成28年度に行う。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成28年度は実験系(細胞表面マーカーを用いたTregの分離・抽出、CFSE suppression assay)が確立し、患者検体を多数用いる段階に入る見込みである。細胞培養関連物品、実験試薬類の大幅な消費が予想されることから、平成27年度差引額を投入するつもりである。また平成28年度から着手する実験として、上清中のサイトカイン濃度測定、TregにおけるサイトカインのmRNA・蛋白発現レベルの測定などがあり、相応の実験コストが予想される。
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