2015 Fiscal Year Research-status Report

FGF2徐放ヒアルロン酸スポンジを用いた軟骨組織再生誘導デバイスの開発

Research Project

Project/Area Number	15K10951
Research Institution	Teikyo University
Principal Investigator	山岡尚世帝京大学, 医学部, 講師 (10444085)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	權太浩一帝京大学, 医学部, 教授 (50254925) 丸山一雄帝京大学, 薬学部, 教授 (30130040) 平林慎一帝京大学, 医学部, 教授 (60173259)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2018-03-31
Keywords	軟骨組織再生 / 足場 / 徐放
Outline of Annual Research Achievements	本研究の目的は、軟骨組織再生において軟骨細胞の増殖および軟骨基質形成を促進するといわれているFGF2を足場から徐放させることにより局所で一定の濃度を保ち、軟骨細胞に持続的に作用するようなシステムを確立させることである。平成27年度はFGF2徐放システムを構築するにあたり、アルジネート溶液、塩化カルシウム溶液、FGF2の各種濃度について検討しシステム作製における至適条件の設定を目指した。具体的には、アルジネート溶液は1%、2%の2種類、塩化カルシウム溶液は0.5M、1M、2Mの3種類、FGF2を含有したヒアルロン酸スポンジは0.1μg、1μg、10μg、20μgの4種類を作製した。ヒアルロン酸スポンジを包埋するアルギン酸ゲルはアルジネート溶液を塩化カルシウム溶液に滴下して作製するが、2%のアルジネート溶液と2Mの塩化カルシウム溶液の組み合わせが最もゲルの弾性率が高値であり、長期における形状保持に有用であると推測された。さらにFGF含有ヒアルロン酸スポンジをアルギン酸ゲルで包埋した後、ポリリジンと反応させてアルギン酸ポリリジン膜を形成し足場を作製した。この足場をPBS溶液中に浸漬し継時的にFGF2の濃度をELISA法で定量した。その結果、20μg のFGF2を含有したヒアルロン酸スポンジを 2%のアルジネート溶液と1Mおよび2Mの塩化カルシウム溶液で作製したアルギン酸ゲルで包埋したサンプルが最も長期にわたりその形状を保ち、一定量のFGF2を放出した。以上の結果より、アルジネート溶液は2%、塩化カルシウム溶液は1Mおよび2M、FGF2は20μgという濃度条件を設定した。次年度はこの条件で作製した足場に軟骨細胞を投与しその親和性を検索する予定である。さらに作製したデバイスをマウスの背部皮下に移植し軟骨組織再生を目指す。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 作製した足場は4週間と長期にわたり形状保持が可能で、同時に一定濃度のFGF2を徐放していることが確認できた。FGF2徐放デバイスのシステム作製における至適条件の検討を27年度中に完了することができたため、研究は概ね順調に進展していると思われる。
Strategy for Future Research Activity	作製した足場に軟骨細胞を投与し、軟骨細胞との親和性について検討する。その結果から足場を構成する各種溶液およびFGF2の濃度条件を再度確認する。さらに軟骨細胞を投与したデバイスをマウスの背部皮下に移植して4週間後に摘出する。摘出したサンプルについては組織学的、生化学的に解析する予定である。
Causes of Carryover	27年度はFGF徐放デバイスの至適条件の決定まで完了したが、軟骨細胞の投与までは至らなかった。そのため、軟骨細胞の購入やin vivoでの検討に使用する試薬の購入に至らず当初の計画より費用が抑えられた。この差額については28年度の研究で使用する予定である。
Expenditure Plan for Carryover Budget	軟骨細胞は、患者からの同意のもと小耳症手術などにおいて採取される余剰な耳介軟骨を薄切した後コラゲナーゼ処理により単離するが、研究を推進するにあたり十分量が獲得できない場合はヒト由来軟骨細胞を購入する。得られた軟骨細胞を投与したデバイスをマウスの背部皮下に移植して4週間後に摘出し、組織学的、生化学的に評価する。具体的には、凍結組織切片の作製、real time PCRを用いたⅡ型コラーゲンなどについての遺伝子検索、ELISAを用いたⅡ型コラーゲンおよびGAGの定量などで評価する。研究の成果は、学会で発表予定である。