三次元細胞培養を用いた力学的負荷に対する骨細胞の機能解析

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K11008
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 佐藤 淳 大阪大学, 歯学研究科, 講師 (70335660)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 阿部 真土 大阪大学, 歯学研究科, 講師 (40448105) ; 岸野 万伸 大阪大学, 歯学研究科, 助教 (60346161) [Withdrawn]
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 骨芽細胞

Outline of Annual Research Achievements

平成２８年度中の研究では、骨基質蛋白質Dmp1が与えられた力学的負荷に対してどのように関与しているかどうかを検討するために、Dmp1遺伝子過剰発現遺伝子組換えマウスから初代骨芽細胞を採取し、三次元コラーゲンゲル上での細胞培養を行ったが、結果として野生型株と比較して明らかな形態変化の違いは、観察されなかったため、平成２９年度は、Dmp1遺伝子ノックダウン細胞株の作製に着手した。
Dmp1遺伝子ノックダウン細胞株の作製にあたり、対象とした用いた培養細胞株は、骨芽細胞としての特徴を有するMC3T3細胞株とした。CRISPR-Cas9での遺伝子編集により、Dmp1遺伝子に変異を生じさせ、正常Dmp1を発現出来ないようになるMC3T3細胞株の樹立を目指した。
CRISPR-Cas9での遺伝子編集後、96穴細胞培養プレート上での限界希釈法を用いて、変異細胞株のクローニングを行い、約100個のクローニング株を樹立することが出来た。これらのクローニング株のそれぞれからDNAを抽出し、DNAシークエンスによるDmp1遺伝子変異の検出を行い、一次スクリーニングを行い、10個程度のDmp1遺伝子変異候補株を選択した。
二次スクリーニングとして、選択したDmp1遺伝子変異候補株から蛋白質の抽出を行い、ウエスタンブロット法を用いて、Dmp1蛋白質の発現検索を行った。ウエスタンブロット法により、Dmp1遺伝子変異候補株におけるDmp1蛋白質発現状態を、野生型MC3T3細胞株におけるDmp1蛋白質発現状態と比較し、両者での発現の変化の検討を行った。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

Dmp1遺伝子ノックダウン細胞株の作製に想定していた以上の時間がかかった。

Strategy for Future Research Activity

引き続き、Dmp1遺伝子発現ノックダウン細胞株の作製に注力し、細胞株の樹立後に種々の検討を行いたいと計画している。

Causes of Carryover

研究の遂行に際して、細胞実験での、遺伝子編集細胞株の樹立のプロセスに時間がかかり、引き続いて行う予定であった実験に取り掛かることが出来なかったため。