2017 Fiscal Year Research-status Report
う蝕原因菌由来新規アセチル化酵素の機能解析とう蝕予防への展開
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15K11011
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
林 幾江 広島大学, 医歯薬保健学研究科(歯), 助教 (00346503)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
菅井 基行 国立感染症研究所, 薬剤耐性研究センター, センター長 (10201568)
小林 純也 京都大学, 放射線生物研究センター, 准教授 (30301302)
小原 勝 広島大学, 病院(歯), 助教 (80253095)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | う蝕 / 細菌 / FACS |
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| Outline of Annual Research Achievements |
口腔常在菌中、streptococcus mutans (ミュータンス菌）とstreptococcus sobrinus （ソブライナス菌）は、う蝕原因菌として知られている。これら原因菌の口腔内における数とカリエス罹患率の関係は議論の対象となっており、う蝕原因菌を対象とした種々の検査法・菌の定量法が提唱されているが、それぞれに改善の余地のある手法といわざるを得ない現状である。
そこで、う蝕原因菌を定量する方法としてフローサイトメーターのFACScanを用いるう蝕原因菌定量法の基礎的検討を行った。健常ボランティアより唾液を採取し検体とした。口腔常在菌の中からう蝕原因菌を特異的に認識するものとして、申請者らが見出したS.mutansに発現しているAmlのdomainを用いて特異的にう蝕原因菌を認識するリガンド法と抗体を用いた方法によりう蝕原因菌を測定するFACScan法を検討し、その有用性や現時点における問題点を評価した。
ウサギ抗Streptococcus mutans抗体(一次抗体)を用い、FITCラベル抗ウサギIgG二次抗体、もしくはFITCを直接ラベルした一次抗体を用いて抗原抗体反応を行い,FACSCaliburでoral floraを展開した。予備実験から、１次抗体並びにFITCラベル１次抗体の至適希釈率を求めた。FACS展開後のゲート設定により、抗体反応Streptococciと他のoral floraの分離定量が可能と思われる結果を得た。蛍光顕微鏡を用いてoral flora中Streptococciに対する反応率を検討したところほぼ100％の反応性を示したが,非特異的反応並びに自己蛍光発色菌の存在の可能性も残されていた。う蝕原因菌を認識するリガンド法は、抗体を用いるよりより特異的にう蝕原因菌を認識する傾向を示した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
う蝕原因菌を定量する方法の確立を目指しフローサイトメーターのFACSCaliburを用いてう蝕原因菌を定量するための基礎的検討を行った。申請者らが見出したS.mutansに発現しているAmlのdomain領域を蛍光標識した組換えタンパクを作成し、各種のレンサ球菌との結合を蛍光を指標に顕微鏡で観察した結果、Amlのdomain領域は特異的にう蝕原因菌のみを認識し結合していたが、S.salivalius, S. mitis, S.sanguiniusなど他のレンサ球菌には結合能を有していなかった。そこで、このAmlのbinding domainの組換えタンパクをリガンドとしてう蝕原因菌を選択的に標識するリガンド法とう蝕原因菌の抗体を用いてう蝕原因菌を認識する抗体法の２種についてFACS検出できるか検討し、その有用性・適応性を調べた。抗体を用いた手法では、より細かに条件検討を行い、抗体の種類、１次抗体のみの場合、間接法として１次抗体、２次抗体を用いた場合の特異性や問題点を検討した。う蝕原因菌の単離・定量法の基礎的検討は順調に進んでいるが、アセチル化酵素の生化学的性状を明らかにするというbasic approachが遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
う蝕原因菌に特異的に発現しているdomain領域やアセチル化酵素をリガンドとする方法について、より詳細に特異性や効率を評価し、う蝕原因菌の検出・定量に使用できる実用性を高めた方策を探る。
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| Causes of Carryover |
う蝕予防への展開を目指したう蝕原因菌の選択的単離に関する研究は予定通り進んでいるが、アセチル酵素をリガンドとしてう蝕原因菌を特異的に検出する手法には至っていない。S.sobrinusの形質転換が通常の方法では行えなかったことから、S.sobrinusと同じペプチドグリカン構造を有するS.criceti, S.downeiを用いて形質転換しアセチル化酵素の生化学的性状を明らかにする。
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