軟骨石灰化不全ラットの形態異常を規定する分子の解明：頭蓋底軟骨と下顎頭軟骨

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K11030
• Research Institution: Asahi University
• Principal Investigator: 永山 元彦 朝日大学, 歯学部, 教授 (50298436)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 田沼 順一 朝日大学, 歯学部, 教授 (20305139)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 軟骨内骨化 / 下顎頭軟骨 / 頭蓋底軟骨 / Ihh / PTHrP / Gli1

Outline of Annual Research Achievements

交付申請における研究目的、研究計画では、自然発症型の軟骨石灰化不全を示すCCIラットは、責任遺伝子のホモ相同染色体で形質発現することから、ダブルヘテロの親CCIラットによる常染色体劣性遺伝によるフェノタイプが生じていることが考えられる。本研究では、先ずこの自然発症型CCIラットの繁殖と交配実験から、責任遺伝子の同定と遺伝子の機能解明を行うため、（１）CCIラットの形質発現に関する責任遺伝子解明（２）CCIラットの病態に関する形態学的および分子生物学的検索（３）CCIラットとヒトにおける発育異常との関連検索としている。
平成27年度は（１）の責任遺伝子解明に向けた研究を行った。その結果、CCIラットのWild type近交系SDラットからの発症頻度がほぼ1/3に近似することが判明し、劣性遺伝で発症することが明らかだった。そこで、親の責任遺伝子ヘテロ接合である場合、常染色体に責任遺伝子が存在すると仮定し、Wild typeの近交系オス、メスの各SDラットと対応するペアのCCIラットとのF1世代を作成して、表現型とその割合を確認しようとしたが、CCIラットとの自然性交が成功しなかった。一方、CCIラットの形態発現の異常の検索も行い、軟骨内骨化への分子シグナルの異常で、Ihh-PTHrPシグナルに関するmRNAの異常高値を検出している。現在はPTHrPの発現についても下顎頭軟骨と頭蓋底軟骨結合において観察しており、２週齢のCCIラットでは、Wild typeのSDラットに比べて下顎頭軟骨の表層には大量の線維層が存在し、この部におけるIhhとGli1のmRNA発現がin situ hybridizationで高いことが判明した。しかし、この結果は同時期の同個体の頭蓋底軟骨結合ではあてはまらず、これらの分子の発現時期が時・空間的に変化しながら軟骨内骨化をしていくことが予想できた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

Wild typeの近交系オス、メスの各SDラットと対応するペアのCCIラットとのF1世代を作成して、表現型とその割合を確認しようとしたが、CCIラットとの自然性交が成功しなかった。これはCCIラットの形態異常なのか、生殖能力としての機能不全なのかが不明なため、この検索を追従して行う必要があると考え、現在、人工的受精などに切り替えるなどの検討をしている。

Strategy for Future Research Activity

現在は（１）の原因遺伝子解明について遅れているが、対策としての人工的受精や生殖能力の確認が取れれば、問題は解決できると考え、引き続き研究計画の（２）CCIラットの病態に関する形態学的および分子生物学的検索（３）CCIラットとヒトにおける発育異常との関連検索を行う予定である。なおすでに（２）の計画は進行中で下顎頭軟骨と頭蓋底軟骨結合での形態発現に関連する分子の時空間的な発現動態が明らかになりつつあり、学会発表、論文発表等を通じてその成果を発表していく予定である。

Causes of Carryover

当該年度に予定していた額の中で、RNA量の簡便な計測が必要となり、当初の予定にはなかった分光光度計の購入をした。そのために、遺伝子解析ソフトとコンピュータの購入を控え、実験の一部が予算的にも時間的にも実行困難となったため、次年度計画に回す予定とした。

Expenditure Plan for Carryover Budget

当初予定の額内での実験計画を遂行するとともに、遺伝子解析ソフトとコンピュータの購入を予定している。ただし、これを回避できる場合には極力実験計画予定の費用に充てたいと考える。

Research Products

• [Journal Article] Establishment of a novel dwarf rat strain: cartilage calcification insufficient (CCI) rats (2015)
  • Author(s): Tanaka M, Watanabe M, Yokomi I, Matsumoto N, Sudo K, Satoh H, Igarashi T, Seki A, Amano H, Ohura K, Ryu K, Shibata S, Nagayama M, Tanuma J.
  • Journal Title: Exp Anim. Volume: 64 Pages: 121-128
  • DOI: 10.1538/expanim.14-0072. Epub 2014 Dec 20.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] Study of Cartilage Calcification Insufficient (CCI) Rat (2016)
  • Author(s): Kohei Kuzushima, Aya Takeuchi, Motohiko Nagayama, Masami Tanaka, Minoru Watanabe, Hitoshi Amano, Jun-ichi Tanuma, Noriyuki Kitai
  • Organizer: 45th Annual Meeting of the AADR/40th Annual Meeting of the CADR
  • Place of Presentation: Los Angeles, CA, USA
  • Year and Date: 2016-03-16 – 2016-03-19
  • Int'l Joint Research