新規CCN２結合分子DCL‐１の破骨細胞成熟促進因子としての新機能の解明

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K11038
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 青山 絵理子 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (10432650)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 滝川 正春 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (20112063) ; 服部 高子 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (00228488) ; 西田 崇 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (30322233) ; 久保田 聡 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (90221936)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: osteoclast / actin ring / CCN2/CTGF / CD302/DCL-1

Outline of Annual Research Achievements

骨、軟骨組織の増殖、分化においてさまざまな生理活性因子が関与していることが知られているが、中でもCCN2はその多機能性と作用機構の特殊性で知られる因子である。この因子は38kDaの分泌タンパク質であるが、他の様々な因子と結合してそれらの機能を制御することにより多機能性を発揮するものと考えられている。そこでその結合因子を見いだすことで新たな機能を解明できると考え、結合因子のスクリーニングを行った。その結果見いだしたCD302はレクチン様ドメインを持つ膜タンパク質の一種であり、マクロファージなどでの発現が知られている因子である。今回我々が注目した破骨細胞はマクロファージ系の前駆細胞から分化するにも関わらず、CD302の発現や機能は全く報告されていなかった。そこで我々はこの因子の遺伝子が成熟破骨細胞において発現していることや破骨細胞の成熟に伴って形成されるアクチンリング周辺に多く存在すること、さらにはCD302の発現を抑制すると骨吸収能が低下することを明らかにした。さらにCD302とアクチンの関連について明らかにすべく以下の検討を行った。破骨細胞の分化過程においてsiRNAを用いてCD302の発現を抑制したところ、TRAP陽性の成熟破骨細胞数が減少した。また、この時の破骨細胞の様子をタイムラプス撮影して観察したところ、すでにアクチンリングを形成している細胞ではリングが断片化する様が見られた。また、免疫沈降法によりCD302はアクチンおよびCCN2のそれぞれと結合することも示された。これらの結果から、CD302はアクチンリングの形成に必須であり、アクチンとの結合性がすでに報告されているCCN2とも結合することからCD302、CCN2およびアクチンの三者が協働してアクチンリングを形成している可能性が示唆される。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

概ね計画通りに進行しているが、CD302のシグナル伝達経路については現在、解析を進めている段階であり、いまだ明確な結論は得られていない。また、破骨細胞分化の過程で発現することが知られている複数の因子の遺伝子発現へのCD302の関与についても解析を行ったが、予想に反してCD302の発現を抑制することでDC-STAMPやCathpsinKといった破骨細胞形成の後期分化に必須の因子の遺伝子発現が促進された。これについては追試験を重ねて慎重に検討する必要があると同時に、この現象が確実なものであると分かった場合に破骨細胞の成熟におけるCD302の役割について整合性のある考察を深めておく必要があると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

CD302の細胞内ドメインにhalf ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif)と呼ばれるアミノ酸配列を有していることが分かったため、これまで予想していたc-Srcやインテグリンavb3のみでなく、ITAMシグナルの下流に位置するSHP-2やSyk、FakなどへのCD302由来シグナルの関与についても併せて検討をすすめる。また、CD302の発現ベクターを作成中であり、これを用いてCD302発現の低いcell lineに強制発現させることでactin ring の形成を促進できるかどうかというgain of functionの実験系を組むことができる。さらにhalf ITAM motifに変異を導入した発現系を用いてCD302の機能におけるこの部分の影響を調べることを計画している。

Causes of Carryover

CD302のシグナル伝達経路として当初、考えていなかったITAMの経路を介している可能性が浮上したため、予定していなかったシグナル経路の解析を行う必要があった。そこで最初に27年度に計画していたCD302の強制発現ベクターの作成とそれを用いたCD302の強制発現による破骨細胞の形態変化などの観察のための時間がなくなり、この実験内容を次年度に繰り越さざるを得なくなったため、そのための費用が未使用額となった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

CD302の強制発現系を立ち上げるだけでなく、前年度の研究結果から示唆されるCD302のITAMモチーフに変異を導入した変異型CD302の発現系も併せて作成し、この配列がCD302の機能に及ぼす影響を検討していく。

Research Products

• [Journal Article] CCN4/WISP-1 positively regulates chondrogenesis by controlling TGF-β3 function. (2016)
  • Author(s): Yoshioka Y, Ono M, Maeda A, Kilts TM, Hara ES, Khattab H, Ueda J, Aoyama E, Oohashi T, Takigawa M, Young MF, Kuboki T.
  • Journal Title: Bone Volume: 83 Pages: 162-70
  • DOI: 10.1016/j.bone.2015.11.007
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Role of CCN2 in amino acid metabolism of chondrocytes (2016)
  • Author(s): Murase, Y,, Hattori, T., Aoyama, E., Nishida, T., Maeda-Uematsu, A., Kawaki, H., Lyons, K. M., Sasaki, A., Takigawa, M., Kubota, S
  • Journal Title: J. Cell Biochem Volume: 117 Pages: 927-937
  • DOI: 10.1002/jcb.25377
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Involvement of multiple CCN family members in platelets that support regeneration of joint tissues (2016)
  • Author(s): Hara, C., Kubota, S., Nishida, T., Hiasa, M., Hattori, T., Aoyama, E., Moriyama, Y., Kamioka, H., Takigawa, M
  • Journal Title: Mod. Rheumatol Volume: In press Pages: In press
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The Role of Sonic Hedgehog Signaling in Osteoclastogenesis and Jaw Bone Destruction. (2016)
  • Author(s): Shimo T, Matsumoto K, Takabatake K, Aoyama E, Takebe Y, Ibaragi S, Okui T, Kurio N, Takada H, Obata K, Pang P, Iwamoto M, Nagatsuka H, Sasaki A.
  • Journal Title: PLoS One. Volume: 11(3) Pages: e0151731
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0151731.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Physical interaction of CCN2 with diverse growth factors involved in chondrocyte differentiation during endochondral ossification (2015)
  • Author(s): Khattab HM, Aoyama E, Kubota S, Takigawa M
  • Journal Title: J Cell Commun Signal. Volume: 9(3) Pages: 247-54
  • DOI: 10.1007/s12079-015-0290-x
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] CCN2 enhances RANKL-induced osteoclast differentiation via direct binding to RANK and OPG (2015)
  • Author(s): Eriko Aoyama , Satoshi Kubota , Hany Mohamed Khattab , Takashi Nishida , Masaharu Takigawa
  • Journal Title: Bone Volume: 73 Pages: 242-248
  • DOI: 10.1016/j.bone
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] CCN family protein 2 (CCN2) promotes the early differentiation, but inhibits the terminal differentiation of skeletal myoblasts (2015)
  • Author(s): Nishida, T., Kubota, S., Aoyama, E., Janune, D., Lyons, K. M., Takigawa, M
  • Journal Title: J Biochem Volume: 157 Pages: 91-100
  • DOI: 10.1093/jb/mvu056
  • Peer Reviewed
• [Presentation] CCN2/CTGFとRANK/TRAILおよびosteoprotegerinとの分子間相互作用を介した破骨細胞形成促進機構 (2016)
  • Author(s): 青山絵理子、久保田聡、西田崇、滝川正春
  • Organizer: 第 33回 岡山免疫懇話会
  • Place of Presentation: 岡山
  • Year and Date: 2016-03-05 – 2016-03-05
• [Presentation] 成熟破骨細胞のアクチンリング形成におけるCD302の機能とCCN2による制御 Novel role of CD302 in actin ring formation in mature osteoclasts and its interaction with CCN2 (2015)
  • Author(s): 青山絵理子、星島光博、服部高子、久保田聡、滝川正春
  • Organizer: 第88回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] 破骨細胞分化における新規アクチン骨格制御因子としてのDCL-1/CD302の役割とCCN2との関連 (2015)
  • Author(s): 青山絵理子、星島光博、服部高子、久保田聡、滝川正春
  • Organizer: 第58回歯科基礎医学会
  • Place of Presentation: 新潟
  • Year and Date: 2015-09-11 – 2015-09-13
• [Presentation] 新たな破骨細胞制御因子DCL-1/CD302の作用機構の解明とCCN2との関連。 (2015)
  • Author(s): 青山絵理子、服部高子、星島光博、久保田聡、滝川正春
  • Organizer: 第３３回日本骨代謝学会学術集会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2015-07-23 – 2015-07-25
• [Presentation] 破骨細胞の成熟を制御する新規膜タンパク質CD302/DCL-1の機能とCCN2との結合。 (2015)
  • Author(s): 青山絵理子、服部高子、星島光博、久保田聡、滝川正春
  • Organizer: 第6回骨バイオサイエンス研究会
  • Place of Presentation: 岡山
  • Year and Date: 2015-07-04 – 2015-07-04
• [Presentation] 成熟破骨細胞の形成におけるCD302/DCL-1の新機能とCCN2との関連。 (2015)
  • Author(s): 青山絵理子、星島光博、服部高子、久保田聡、滝川正春
  • Organizer: 第1回日本骨免疫学会
  • Place of Presentation: 沖縄
  • Year and Date: 2015-06-30 – 2015-07-02