2017 Fiscal Year Annual Research Report
Mechanism and expression of CD302 as a new regulator of osteoclast maturation
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15K11038
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
青山 絵理子 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (10432650)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
滝川 正春 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 教授 (20112063)
服部 高子 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (00228488)
西田 崇 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 准教授 (30322233)
久保田 聡 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 教授 (90221936)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | CD302/DCL-1 / osteoclast / actin / actin ring / CCN2/CTGF |
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| Outline of Annual Research Achievements |
CCN2およびCD302のタンパク質間相互作用を確認するためヒトCCN2のリコンビナントタンパク質およびヒトCD302細胞外ドメインのリコンビナントタンパク質を用いて固相化結合実験および共沈降実験を行ったところ、いずれの方法でも相互作用は検出できなかった。このことから少なくともCD302の細胞外ドメインはCCN2と反応しないことが分かった。
また、N末端側にFLAGタグが付加されたマウスCD302を発現するベクターを作製し、サル腎臓由来肉腫細胞株であるCos7細胞で発現させたところ、ベクターtransfection後2日目および３日目にウエスタンブロットによってCD302タンパク質の発現が最大になっていることが確認できた。しかし、同サンプルでFLAGタグに対する抗体を用いたウエスタンブロットではバンドを検出できなかったため、シグナルペプチドと共にタグが切断されていると考えられる。そこでC末端側にMycタグを付加されたマウスCD302を発現するベクターを作製し直してCos7細胞にtransfectionして強制発現させた。しかし前回と同様、抗CD302抗体を用いたウエスタンブロットでは発現が確認できたが、Mycタグに対する抗体では発現が確認できなかった。このことからCD302は翻訳後に膜移行するまでにC末端側でなんらかの修飾あるいは切断がなされている可能性が考えられる。
これらの発現ベクターによって強制発現させたCD302とアクチンあるいはCCN2タンパク質と相互作用を確認するため抗CD302抗体あるいは抗アクチン抗体を用いて共沈降実験を行ったが、いずれも相互作用は確認できなかった。ただし、この時の実験系では免疫沈降そのものが確認できていないので実験条件を再検討する必要がある。
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