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2015 Fiscal Year Research-status Report

膜トラフィッキング制御分子による破骨細胞分化と骨吸収の新たな調節機能の解明

Research Project

Project/Area Number 15K11046
Research InstitutionSaga University

Principal Investigator

久木田 明子  佐賀大学, 医学部, 准教授 (30153266)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 久木田 敏夫  九州大学, 歯学研究科(研究院), 教授 (70150464)
Project Period (FY) 2015-04-01 – 2018-03-31
Keywords破骨細胞 / 膜タンパク質 / 分化 / 小胞輸送
Outline of Annual Research Achievements

破骨細胞は膜表面に面した膜に酸や酵素を盛んに分泌する極性を持った多核細胞で、その成熟破骨細胞への分化過程には小胞輸送の様々な過程が関わっている。しかしながらその調節機構はまだ不明な点が多い。本年度においては、申請者らがマイクロアレイ解析で明らかにした膜トラッフィッキングの調節因子Nedd4アダプタータンパク質の破骨細胞分化おける発現と機能の解析及びノックアウトマウスの作成を行なった。Nedd4アダプタータンパク質は、マクロファージ細胞RAW264 や骨髄マクロファージにRANKLを添加すると発現が24時間で上昇し、免疫染色ではプラスチック上で破骨細胞の前駆細胞に発現が見られたが、多核の破骨細胞に発現が見られなかった。しかし、骨髄由来の破骨細胞前駆細胞を象牙質の上で培養し形成した破骨細胞において強く発現することがわかり、破骨細胞での発現誘導に骨基質成分からの刺激が関与すると考えられた。さらにこのタンパク質の細胞内の局在を調べた結果、エンドソームやカテプシンKとの共局在が認められた。また、ラットアジュバント関節炎の骨破壊部位の免疫染色によりin vivoの破骨細胞において発現していることがわかった。このNedd4アダプタータンパク質の機能を調べるため、RAW264 細胞でsiRNAにより発現を抑制すると、破骨細胞の分化が抑制された。さらにマクロファージRAW264 細胞でその発現を抑制した時の、細胞表面のCD11bとRANKの発現をFlow cytometryにより解析した結果、RANKの発現が選択的に抑制され、細胞表面への輸送の制御に関わることが考えられた。さらに、Crisper-Cas9システムを用いてこのタンパク質のノックアウトマウスの作成を試みた。ゲノム解析を行ない、germlineの伝達とヘテロノックアウトマウス樹立を確認した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度においては、Nedd4アダプタータンパク質の発現誘導の詳細な解析を行い、その機能をsiRNAによる発現抑制により明らかにし、さらにノックアウトマウスを作成することが目的であった。その結果、プラスチック上では発現が誘導されず、骨の上でのみ破骨細胞において発現が誘導されるという誘導機構が明らかになった。この発現誘導に関わる骨基質成分についても解析を行なっており、非常に独特な発現誘導をするタンパク質であることが明らかになった。さらに、このタンパク質の発現の抑制がRANKという破骨細胞の分化に重要なタンパク質の細胞表面への輸送に関わることも明らかにした。また、Crspr-Cas9システムを用いてノックアウトマウスを作成することも出来た。

Strategy for Future Research Activity

今年度の結果をもとに、Nedd4アダプタータンパク質の機能の詳細を明らかにしていく。どのようなタンパク質と相互作用するか、破骨細胞における活性化のシグナル因子や伝達機構と関わりについて解析を行なう。またノックアウトマウスを用いてin vivoにおける働きや骨代謝における機能についての解析を行なう。

Causes of Carryover

本年度においてはCrisper-Cas9システムを用いたノックアウトマウスの作成等に費用を当てていたが、共同研究で行なったことと、予想より多くの実験を必要としなかったことから、物品費に余裕が生まれた。来年度で行なうタンパク質の機能解析やマウスの解析には予想より多くの費用を要することが考えられるため、来年度の研究費に使用することにする。

Expenditure Plan for Carryover Budget

来年度においては、ノックアウトマウスを用いてμCTを用いたマウスの骨量の測定や尿中のコラーゲン分解物を測定し骨代謝の動態等を解析する。さらに様々な抗体を購入しノックアウトマウスの細胞由来の破骨細胞の分化や活性化についてWestern解析、共焦点レーザー顕微鏡による解析及びFlow cytometryによる解析を行なう。

  • Research Products

    (9 results)

All 2016 2015 Other

All Journal Article (3 results) (of which Peer Reviewed: 2 results) Presentation (5 results) (of which Invited: 1 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] Generation mechanism of RANKL+ effector memory B cells: its relevance to the pathogenesis of rheumatoid arthritis2016

    • Author(s)
      Ota Y., Niiro H., Ota S., Ueki N., Tsuzuki H., Nakayama T., Mishima K., Higashioka K., Jabbarzadeh-Tabrizi S., Mitoma H., Akahoshi M., Arinobu Y., Kukita A., Yamada H., Tsukamoto H., Akashi K.
    • Journal Title

      Arthritis Reseach & Therapy

      Volume: 印刷中 Pages: 印刷中

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Interferon-gamma improves impaired dentinogenic and immunosuppressive functions of irreversible pulpitis-derived human dental pulp stem cells.2016

    • Author(s)
      Sonoda S, Yamaza H, Ma L, Tanaka Y, Tomoda E, Aijima R, Nonaka K, Kukita T, Shi S, Nishimura F, Yamaza T.
    • Journal Title

      Sci Rep.

      Volume: 6 Pages: -

    • DOI

      doi: 10.1038/srep19286.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Membrane Nanotube Formation in Osteoclastogenesis.2015

    • Author(s)
      Kukita T., Takahashi A., Zhang J-Q., Kukita A
    • Journal Title

      Methods. Mol. Biol.

      Volume: 1313 Pages: 193‐202

    • DOI

      doi: 10.1007/978-1-4939-2703-6_14.

  • [Presentation] POZ-ZF転写制御因子LRF/OCZFの破骨細胞の分化と機能における役割2015

    • Author(s)
      久木田 明子, 徐 祥赫, 菖蒲池 健夫, 武智 香織, 古賀 貴子, 白木 誠, 蒲原 麻菜, 久木田 敏夫, 高柳 広
    • Organizer
      第38回日本分子生物学会年会 第88回日本生化学会大会 合同大会(ワークショップ)
    • Place of Presentation
      神戸ポートピアホテル(兵庫県神戸市)
    • Year and Date
      2015-12-01 – 2015-12-04
    • Invited
  • [Presentation] OCZF(Zbtb7a)タンパク質の破骨細胞分化における発現誘導とその機能の解析2015

    • Author(s)
      久木田明子、徐祥赫、久木田敏夫
    • Organizer
      第57回歯科基礎医学会
    • Place of Presentation
      朱鷺メッセ(新潟県新潟市)
    • Year and Date
      2015-09-11 – 2015-09-13
  • [Presentation] Galectin-9による破骨細胞形成抑制機構:MafB制御関与の可能性2015

    • Author(s)
      久本由香里、上原範久、久木田明子、久木田敏夫
    • Organizer
      第57回歯科基礎医学会
    • Place of Presentation
      朱鷺メッセ(新潟県新潟市)
    • Year and Date
      2015-09-11 – 2015-09-13
  • [Presentation] ラミニン332によるRANK発現調節とマクロファージ-破骨細胞分化転換の制御2015

    • Author(s)
      上原範久、久木田明子、久本由香里、保田尚孝、久木田敏夫
    • Organizer
      第33回日本骨代謝学会
    • Place of Presentation
      京王プラザホテル(東京都)
    • Year and Date
      2015-07-23 – 2015-07-25
  • [Presentation] Novel Role of Nedd4 adaptor protein, Pmepa1 in the differentiation and function of osteoclasts.2015

    • Author(s)
      Xu Xianghe, Noboru Funakubo, Makoto Shiraki, Toshio Kukita, Akiko Kukita
    • Organizer
      第33回日本骨代謝学会
    • Place of Presentation
      京王プラザホテル(新宿)
    • Year and Date
      2015-07-23 – 2015-07-25
  • [Remarks]

    • URL

      http://www.microbio.med.saga-u.ac.jp/biodefense/per-kuki.html

URL: 

Published: 2017-01-06  

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