2015 Fiscal Year Research-status Report
酸感受性イオンチャネルを介した新しい味覚受容機構の解明
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15K11049
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
植田 高史 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (90244540)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
柴田 泰宏 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (10534745)
鵜川 眞也 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (20326135)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 口腔生理学 / 味覚受容体 / 酸感受性イオンチャネル / P2X2/3 ATP受容体 / 膝神経節 / RT-PCR / in situ hybridization / 免疫組織化学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１．マウス味蕾組織におけるRT-PCR法によりASIC1a, 1b, 2b, 3の転写産物の存在が示唆されたが、味蕾を含まない舌組織でも同程度の発現を示した。そこでin situ ハイブリダイゼーション (ISH)法によりASIC1a mRNAの発現を検索したが、その味蕾組織における存在は確認できなかった。従って、我々の先行研究で観察された味蕾でのASIC1の免疫陽性反応は、味細胞ではなく味蕾に伸びてきている神経線維である可能性が高い。そこで、味覚伝達ニューロンで大部分が占められている膝神経節(geniculate ganglia, 以下GG)にてASICの解析を行った。RT-PCR法ではGG組織にASIC1a,1b, 2b, 3の遺伝子断片が確認され、ISH法ではその発現が一部のニューロンに限局していることを見出した。味覚伝達に重要なP2X2受容体とASICの二重蛍光ISH法を行ったところ、４つのASICサブタイプのうちASIC1aがP2X2と関連深いことが判明した。さらにASIC1に対する抗体を用いてタンパクレベルにおいても解析を行ったところ、確かにGGにおけるASIC1陽性反応はP2X2陽性ニューロンに高頻度で観察されることがわかった。現在GGニューロンにおいて、カルシウムイメージングを施行して、その機能の解析を試みている。
２．マウス味蕾にてASIC4の発現も示唆されていたので、ASIC4tm1a(KOMP)mbpマウスを用いて詳細に解析した。このマウスではASIC4のプロモーターの下流にlacZを発現しており、βガラクトシダーゼ染色によりASIC4の生体内での局在を可視化することができる。このマウス味蕾を観察したところ、明らかなβガラクトシダーゼ陽性像は検出できなかった。GGでもその発現を検索したが、現在までのところポジティブな結果を得るに至っていない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
基本的な分子生物学的及び形態学的な解析なので予定どおりスムーズにデータを得ることができた。ただASIC4については、遺伝子のクローニングとHEK293細胞への強制発現系を用いた解析により、購入した市販抗体が機能しないことが判明したため、急遽その発現を、別研究で作製したASIC4tm1a(KOMP)mbpマウスにて行った。味蕾におけるASICについては、RT-PCRレベルでは他の研究室でも解析されており、少なくとも酸味を感じるとされるIII型味細胞においてASIC遺伝子断片発現の報告はない。我々の結果はこの結果と一致しており、ASICは味蕾味細胞よりもむしろその細胞からシグナルを受け取る神経節細胞で重要な役割を担っている可能性が高い。本年度の結果より、多くのASICサブユニットがこの味覚シグナル伝達に関与していることが示唆されているが、当面はカルシウム透過性を有し、かつ、脳内の水素イオンを介したシナプス伝達に重要なASIC1aに絞り実験を行っている。ただこのASIC1aは脳内にも豊富に発現しているため、当初の予定であった行動解析用のリッキングカウント実験システムの購入は中止して、別の手段を検討している。
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| Strategy for Future Research Activity |
多種のASIC (1a, 1b, 2b, 3)が味覚を伝える膝神経節(GG)ニューロンに発現していることが明らかとなった。今後、まだn数が不十分な分子生物学的及び形態学的な解析を行いながら、これらの生理学的な解析を行う予定である。シナプスを介した神経伝達では細胞内カルシウムの変動が重要な細胞内イベントであるので、まずASICファミリーで唯一カルシウムを通すASIC1aについてカルシウムイメージング法を利用し解析する。GGニューロンにおけるカルシウムイメージングについては先行研究があり [Vandenbeuch et al., J Physiol, 593.5, 1113-1125, 2015; Larson et al., J Neurosci, 35(48), 15984-15995, 2015]、まずこれら論文中の実験結果を再現できるまで実験系を吟味した後、GGニューロンが水素イオンに応答して細胞内カルシウムを上昇させるか否かなどについて解析する。水素イオンに応答して細胞内カルシウムを上昇させるならば、水素イオンは神経伝達物質と考えられる。一方、そこまではいかないまでもATPや5-HTに対するGGニューロンの応答を水素イオンが修飾するならば、水素イオンは神経伝達修飾物質として位置付けられ、新たな発見となる。一方、味覚の実験では行動解析が必須であるためリッキングカウント実験システムを初年度に購入する予定であったが、このASIC1aが脳に豊富に発現しているため購入を中止し、まずカルシウムイメージング法にて解析を行った後、鼓索神経や舌咽神経での味神経応答記録、in vivoのGGにおけるカルシウムイメージングなどの解析を予定している。
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| Causes of Carryover |
今年度の実験を行ったところ、ASICファミリーのうちASIC1aが重要であることが示唆された。ASIC1aは脳機能にも重要な分子で、行動解析を行っても、味覚がおかしいのか、あるいは脳の経路がおかしいかが判断できず、初年度に購入予定であったリッキングカウント行動解析用実験システム（予算として1,880,000円を計上）の購入を中止したため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
我々が実験を進めている間に、味覚に重要なニューロンが集まる膝神経節(GG)でのイメージング法を利用した学術論文が２報発表された [Vandenbeuch et al., J Physiol, 593.5, 1113-1125, 2015; Larson et al., J Neurosci, 35(48), 15984-15995, 2015] 。我々もまずこの解析法の確立に取り組み、この手法を用いて水素イオンが神経伝達物質として、あるいは神経伝達修飾物質として機能するか否かなどを探る。当初は味細胞レベルでの解析を行う予定であったが、これに追加してGGでの解析を行う。さらに行動解析に替わる実験方法として、in vivoのGGにおけるカルシウムイメージング [Barretto et al., Nature, 517, 373-376, 2015; Wu et al., Nat Commun, 6:8171, 2015] の実施を模索する。２つの追加実験にかかる費用はリッキングカウント実験システムの予算から計上する。
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Research Products
(4 results)
