酸感受性イオンチャネルを介した新しい味覚受容機構の解明

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K11049
• Research Institution: Nagoya City University
• Principal Investigator: 植田 高史 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 准教授 (90244540)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 柴田 泰宏 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 助教 (10534745) ; 鵜川 眞也 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 教授 (20326135)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 口腔生理学 / 味覚受容体 / 酸感受性イオンチャネル / P2X2/3 ATP受容体 / 膝神経節 / mRNA解析 / タンパク質発現解析 / 機能解析

Outline of Annual Research Achievements

昨年度の実験より、酸感受性イオンチャネルであるASICは、味覚受容器である味蕾味細胞よりはむしろ二次味覚伝達経路である神経節細胞に豊富に発現していることが示唆された。そこで本年度はまず個体数を増やしてこの結果を再確認した。RT-PCR法よれば、味覚伝達ニューロンで占められている膝神経節(geniculate ganglia, 以下GG)ではASIC1a,1b, 2b, 3の遺伝子断片が確認され、ISH法ではその発現が一部のニューロンに限局していることを見出した。GGニューロンは大きくP2X2/3受容体陽性とP2X3のみ陽性のニューロンに分類される。P2X2並びにP2X3受容体とASIC1の二重蛍光免疫染色法を行ったところ、ASIC1aがP2X2/3受容体陽性ニューロンと関連深いことが判明した。さらにGGニューロンにおける酸（プロトン）の影響について調べるために初代培養GGニューロンを直接カルシウムイメージングにて解析する方法の確立を試みた。試行錯誤の結果、単離した細胞からATPや5-HTに対する容量依存的な応答が観察できるようになり、この方法によれば、GGニューロンはそのATPや5-HT応答性において多様であることが明らかとなり、さらに、n数は少ないものの、酸は直接的にGGニューロンのカルシウム応答を惹起しないが、ATP応答性を種々の程度に修飾することが観察されている。また、並行してP2X2やP2X3受容体をCHO-K1細胞に強制発現させ、この酸修飾のメカニズムについても調べているが、P2X2/3両受容体陽性細胞では、そのリガンド応答性が酸(pH6.5)により増強する一方、P2X3陽性細胞では同応答性が酸によって抑制されることを見出した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

基本的な分子生物学的及び形態学的な解析は予定どおりスムーズにデータを得ることができた。この実験により、ASICが味覚伝達経路に発現していることが明らかとなり、興味深いことに、カルシウム透過性を有し、かつ、脳内の水素イオンを介したシナプス伝達に重要なASIC1aがGGのP2X2/3陽性ニューロンに優位に発現しているとの新知見が得られた。味覚に関与しない三叉神経節細胞においてASIC1はP2X3とあまり共発現しないことから興味がもたれる。さらに味覚受容におけるASIC1aの役割についても研究を進めるため、GGニューロンを用いたカルシウムイメージングの実験系の確立を目指したところ、先行研究[Vandenbeuch et al., J Physiol, 593.5, 1113-1125, 2015; Larson et al., J Neurosci, 35(48), 15984-15995, 2015]と同程度のATP及び5-HT応答反応を観察できるようになり、現在この実験系により新知見も得られ始めている。

Strategy for Future Research Activity

様々なASICサブタイプ (1a, 1b, 2b, 3)が味覚を伝える膝神経節(GG)ニューロンに発現していることが明らかとなった。ASIC1aについては良い市販抗体があり研究が進んでいるが、他のASICについては良い抗体がなく解析途中である。今後はASIC3ノックインマウスなどを使用してASIC1以外のASICサブタイプについても分子生物学的及び形態学的な解析を進めていく。シナプスを介した神経伝達では細胞内カルシウムの変動が重要な細胞内イベントであり、現在ASICファミリーで唯一カルシウムを通すASIC1aについてカルシウムイメージング法を活用し解析している。今年度独自の実験系を構築し先に別のグループから報告された実験結果を再現できるまでになったので、GGニューロンがプロトン（水素イオン）に応答して細胞内カルシウムを上昇させるか否かなどについてさらに解析する。プロトンに応答して細胞内カルシウムを上昇させるならば、水素イオンは神経伝達物質と考えられる。一方、そこまではいかないまでもATPや5-HTに対するGGニューロンの応答を水素イオンが修飾するならば、水素イオンは神経伝達修飾物質として位置付けられ、新たな発見となる。一方、リッキングカウント実験システムを初年度に購入する予定であったが、現在これについては保留とし、まずカルシウムイメージング法による解析を先に行う。その後、味覚の研究に必須とされる鼓索及び舌咽神経での味神経応答解析やリッキングの行動解析の必要性を再検討し、必要があれば実施する予定である。

Causes of Carryover

今年度までの実験でASICファミリーのうちASIC1aがまず重要であることが示唆された。当初ASIC1aは脳機能にも重要な分子で、行動解析を行っても、味覚がおかしいのか、あるいは脳の経路がおかしいかが判断できず、初年度に購入予定であったリッキングカウント行動解析用実験システム（予算として1880000円を計上）の購入を保留しているが、最終的にはこうした行動解析も行い、脳も含めたASICの味覚伝達における役割を考える必要性も議論されており、今年度もあまり予算を執行することなく実験を実施したため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

我々の研究室でも二次味覚ニューロンが集まる膝神経節(GG)でのイメージング法を利用した実験系を確立することができた (Vandenbeuch et al, 2015; Larson et al, 2015)。現在この手法を用いてプロトン（水素イオン）が味覚伝達において神経伝達物質あるいは神経伝達修飾物質として機能するか否かなどの解析を行っている。ただ味覚の研究では、１）味蕾レベル、２）伝導路レベル、３）個体レベルでの研究が必要とされるため、最終年度は、1)と2)のレベルでの他のASICサブユニットについての解析を行うと共に、ASICノックアウトマウスを活用し、鼓索及び舌咽神経の神経応答解析（九州大学の味覚研究グループとの共同研究）、味覚嗜好の行動実験実験（初年度以降購入を保留しているリッキングカウント行動解析用実験システムの利用）を再検討している。