経口ワクチン接種時のパイエル板における粘膜免疫誘導機序の解明

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K11085
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 瀧澤 智美 (橋爪智美) 日本大学, 松戸歯学部, 助教 (50419785)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 経口ワクチン / サルモネラ / 分泌型IgA

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、経口ワクチン接種時におけるパイエル板での粘膜免疫誘導メカニズムの解明である。前年度では、脾臓、腸間膜リンパ節、パイエル板から分離した細胞の中のうちパイエル板のリンパ球のみが経口投与された組換え型サルモネラに対する抗原特異的IgA抗体を産生したという結果を得た。従って、当該年度では主要な役割を果たしているサブセットについてさらに細かく調べるため、パイエル板のリンパ球の中でもどの種類の免疫担当細胞が重要であるのか検討した。脾臓、腸間膜リンパ節、パイエル板から分離したリンパ球をさらに、CD4陽性T細胞、B220陽性B細胞に分離した。同時にあらかじめ組換え型サルモネラを経口免疫したマウスの脾臓あるいはパイエル板からCD11c陽性樹状細胞を分離精製した。これらの細胞を様々な組み合わせで共培養し、培養上清中に産生されたサルモネラ特異的IgA抗体量についてELISA法、ELISPOT法を用いて解析した。その結果、パイエル板由来のB220陽性B細胞を含んだ共培養系においてのみサルモネラ特異的IgA抗体が産生され、サルモネラ特異的IgA産生細胞数が有意に増加した。一方、培養中にパイエル板のCD4陽性T細胞が存在しても、脾臓と腸間膜リンパ節由来のB220陽性B細胞と共培養した場合、サルモネラ特異的IgA抗体は産生されなかった。また、どの組織から分離してきた樹状細胞を用いても、パイエル板由来のB220陽性B細胞からサルモネラ特異的IgA抗体が産生された。以上のことから、経口投与された組換え型サルモネラに対する抗原特異的IgA抗体産生応答にはパイエル板のB220陽性B細胞が重要な役割を果たしていると示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

前年度までに得た、経口投与された組換え型サルモネラに対する抗原特異的IgA抗体応答にはパイエル板由来の免疫担当細胞の中でもリンパ球サブセットが重要であるという結果を踏まえ、さらに詳細なリンパ球サブセット（CD4陽性T細胞、B220陽性B細胞、CD11c陽性樹状細胞）をパイエル板から分離しそれぞれのサブセットについてサルモネラ特異的IgA抗体産生誘導が誘導されるかどうか解析を加えた。その結果、組換え型サルモネラに対する抗原特異的IgA抗体産生誘導にはパイエル板のB220陽性B細胞サブセットが最も主要な役割を果たしていることが示唆された。一方で近年注目を集めているパイエル板由来の樹上細胞のユニークな特徴は本研究では必要ではない可能性が示唆された。これらの結果から経口投与された組換え型サルモネラに対する腸管のIgA粘膜免疫応答誘導メカニズムにおいてパイエル板由来B220陽性B細胞の必要性が判明し、抗原特異的腸管IgA抗体応答誘導メカニズムの解明が進展したと考える。

Strategy for Future Research Activity

当該年度の研究結果を踏まえ、今後は、パイエル板のB細胞サブセットの中でも、どのサブセット（IgA陽性B細胞、IgA陰性B細胞、B220陽性B細胞、B220陰性B細胞、CD138陽性B細胞）が経口投与されたサルモネラ特異的IgA抗体応答誘導に主要な役割を果たしているかについて検討を加える。
当該年度で問題となった点は、前年度までと同様に、培養に必要な量のパイエル板由来のCD11c陽性樹上細胞とCD4陽性T細胞数を限られた状況で最大限確保することである。実際、パイエル板ではCD4陽性T細胞の絶対数が非常に少ない。各細胞サブセットの収量を高める工夫を前年度に引き続き検討していく。具体的には培地の栄養条件を検討する。細胞抽出作業を簡略化しスピーディーに行う、磁気ビーズを用いた各細胞サブセットの分離条件の検討などを逐一行っていく。
さらに、サルモネラ特異的IgA抗体応答誘導に重要な役割を果たす細胞サブセットが判明した場合には、そのサブセットに関して遺伝子レベル、分子レベルで検討していく。最終的には主要な役割を果たす細胞サブセットの生体内での実際のメカニズムを解析する。

Causes of Carryover

当該年度において共培養に必要な最低量のCD11c陽性樹状細胞、CD4陽性T細胞を各組織（特にパイエル板由来CD4陽性T細胞）から分離する過程がスムーズにはいかず、これらサブセットの効率の良い分離方法を現在も引き続き検討中である。そのため、当初計画予定であった、パイエル板由来B220陽性B細胞をさらに細かく（IgA陽性B細胞、IgA陰性B細胞、B220陽性B細胞、B220陰性CD138陽性B細胞）分けて分離し、それぞれのサブセットに関してサルモネラ特異的IgA抗体産生が誘導されるかどうか検討することが当該年度中に出来なかったため。これらのB細胞サブセットを分離する際に必要となる消耗品費を次年度に繰り越すため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

各リンパ組織から、IgA陽性B細胞、IgA陰性B細胞、B220陽性B細胞、B220陰性CD138陽性B細胞、CD4陽性T細胞、CD11c陽性樹状細胞を分離するための試薬一式(ビーズ標識抗体,biotin、streptavidin標識抗体等）。また、厳密にIgA陽性とIgA陰性を分離するために、フローサイトメーターを用いたセルソーティングを実施するのにかかる費用（蛍光標識抗体、FACSariaによるセルソーティング使用費用等）分として次年度に合わせて使用する予定。
また、繰越金に加えて、当初の計画通り、次年度ではパイエル板由来細胞の中で主要な働きをするサブセットが判明した場合には、他のサブセットと比較して相違点について分子レベル（蛍光標識抗体一式代、フローサイトメーター用試薬一式代）、遺伝子レベル（リアルタイムPCR用試薬一式代、マイクロアレイ一式代）で検討を行っていく。