2015 Fiscal Year Research-status Report
ｐ６３がもつ口腔癌の悪性転化抑制能をゲノム編集により解析する
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15K11090
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| Research Institution | Kanagawa Dental College |
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Principal Investigator |
倉田 俊一 神奈川歯科大学, 歯学部, その他 (60140901)
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2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | p63 / ゲノム編集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
TP63(p63)はがん抑制遺伝子TP53(p53)ファミリー遺伝子の１つであるが、癌での変異頻度は極めて低く、高分化型の頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)で高発現している。p63からは転写活性化能をもつTA型(TAp63)と転写開始点が下流にあるためN末端が短いΔN型(ΔNp63)のアイソフォームが産生される。TAp63はp53と類似する機能を果たし、ΔNp63は癌の悪性化を抑制すると考えられている。p63の機能を詳しく解析するため、CRISPR-Cas9法を用いてアイソフォーム別に欠失させる計画を立て、まずTAp63の第1エクソンの相同組換えによるノックアウトを試みた。
HNSCCでは高頻度にp63領域が増幅しているが、実験に用いたFaDu細胞では増幅がないことをPCRにより確認した。pCas9-Guide プラスミド(RNA標的配列とCas9)およびドナー・ベクター(相同性アーム配列と薬剤耐性遺伝子PuroRカセット)を導入し、エピソームが消失する25日後まで継代を繰り返し、耐性細胞を単離した後、サブクローニングを行った。ゲノムDNAを精製しPCRで解析すると、設計通りの組換えが起こったことが多数の細胞で確認できたが、平成27年度に得られた細胞は全てヘテロ組換え体であった。ホモ組換え体を作成するために、再度プラスミドの導入と薬剤耐性による選択を行っている。
また、ΔNp63の機能の解析では、Wnt/βカテニン応答性遺伝子発現を抑制する機能を検出したが、HEK293細胞においてはβカテニン依存性に転写を促進する場合があった。HEK293細胞ではアデノウイルスのオンコジーンE1aとE1bを発現しており、p63とTCF/LEF、βカテニン、E1aの相互作用をレポータアッセイにより解析した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
TAp63をコードするmRNAの翻訳開始配列AUGをノックアウトしても、mRNAにはいくつものAUGコドンが存在し、他のアイソフォームが翻訳される可能性が高い。そのため、本研究ではTAp63の第1エクソンを相同組換えによりノックアウトし、TAp63のmRNAが合成されないようにする計画を立てた。ドナー・ベクターにより［左アーム・GFP・PuroR・右アーム］が与えられるので、ノックアウトを検出するため数種類のプライマーを設定してPCRを行った。また、組換え細胞を選択するピューロマイシン濃度の調整、薬剤選択の前に5回以上の継代培養を行いエピソームとして存在するプラスミドを除去するなどの工夫を行った。
本年度実施した実験により、p63をTAとΔNのアイソフォーム別にノックアウトする技術の基盤ができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
１. ホモ接合体でのノックアウト細胞を得て、TAp63ノックアウト細胞とする。その細胞を用いて、(1)DNA損傷への応答、(2)遺伝子発現への影響 を解析し、TAp63アイソフォームの口腔扁平上皮癌における機能を明らかにする。
２．同様の方法によりΔNのノックアウト細胞を作成する。(1)悪性転化（分化能の消失）(2)遺伝子発現への影響を解析し、ΔNp63が癌の悪性化を阻害する機構について検討する。
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| Causes of Carryover |
2倍体細胞(FaDu)に対して、ゲノム編集を行ったが、2つ存在するp63アレルの片方のみが編集された細胞しか得ることができなかった。そこで、もう一方のp63アレルに対して再度ゲノム編集を行うこととなったので、次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
Origene社のgenome-wide knockout kit using Crispr を用いる。pCas-quide プラスミド(gRNAベクター)にエキソン1 (TAp63の破壊) またはエキソン3’ (ΔNp63の破壊) の転写開始点のguide配列を挿入するとともに、puromycin耐性遺伝子カセットを含むドナーベクターを構築する。puromycin耐性細胞を選択する。選択細胞からゲノムDNAを精製し、PCR法により策定部位にドナーカセット配列が挿入されていることを確認する。数種のguide配列とdonor配列の組み合わせを試みる。Creベクター導入によりPuroを欠失させ、もう一方のアレルに関して同様の操作を行う。これらの研究のために次年度使用額を用いる。
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[Presentation] Chemokine CXCL14 is a multistep tumor suppressor.2015
Author(s)
Ryu-Ichiro Hata, Kazuhito Izukuri, Yasumasa Kato, Soichiro Sasaki, Chihiro Miyamoto, Tetsu Akasaka, Xiaoyan Yang, Yojiro Maehata, Yoji Nagashima, Kazuyoshi Takeda, Tohru Kiyono, Naofumi Mukaida, Masaru Taniguchi
Organizer
2015 American Association of Cancer Research Annual Meeting
Place of Presentation
Philadelphia
Year and Date
2015-04-18 – 2015-04-18
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