2017 Fiscal Year Annual Research Report
Genome editing for p63 in a head-and-neck squamous carcinoma cell line
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15K11090
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| Research Institution | Kanagawa Dental College |
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Principal Investigator |
倉田 俊一 神奈川歯科大学, 歯学部, 特任教授 (60140901)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | p63 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
癌抑制遺伝子p53ファミリーのひとつであるp63（TP63)は、高分化型の頭頸部扁平上皮癌で高頻度に高発現し、分化能の維持に不可欠である。p63遺伝子には2つの転写開始点が存在し、TA-p63とΔN-p63として発現し、さらにスプライシングによるアイソフォームが生じる。ノックアウトマウスでは発癌と悪性転化の解析が不十分であり、各アイソフォームのsiRNA法によるノックダウン法は確立されていない。p63の機能解析を容易にするためにCRISPR-Cas9法を使って、相同組換えによりTA-p63の第1エキソンをノックアウトする実験を試みた。
標的配列を含むガイドRNAとCas9を持つ「ガイドベクター」と切断部位で相同組換えを行う「ドナーベクター」を扁平上皮癌細胞に導入して、ドナーベクターが持つ薬剤耐性遺伝子による細胞の選択を行った。当初、ピューロマイシン耐性遺伝子(PuroR)べクターによって得た耐性細胞のクローンは高率に目的配列の正確な組換えを起こしていたが、すべてが片アレル性に起こっていた。両アレル性のノックアウト細胞を得るために、得られた片アレル編集細胞に再度同じベクターを導入して選択する、薬剤の濃度を変更する、などの方法を検討したが、両アレル性のp63ノックアウト細胞は得られなかった。
そのため、PuroRをネオマイシン耐性遺伝子(NeoR)に変換したドナーベクターを作成し、PuroR組換え細胞に再度導入後、G418とピューロマイシンで選択した。その結果、PuroRとNeoRを各アレルに持つノックアウト細胞が得られた。このように2種類の薬剤耐性遺伝子を使って、2段階で行うことにより、両アレル性のTA-p63ノックアウト細胞が得られた
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