Micro RNAプロファイルを基にしたオーダーメイド歯周組織再生治療法の確立

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K11215
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 岩田 倫幸 広島大学, 大学病院, 助教 (30418793)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 水野 智仁 広島大学, 大学病院, 講師 (60325181) ; 兼田 英里 広島大学, 大学病院, 歯科診療医 (30736426) [Withdrawn]
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 再生歯学 / 歯周組織再生治療 / micro RNA / 間葉系幹細胞

Outline of Annual Research Achievements

歯周組織再生治療において、細胞移植に用いる間葉系幹細胞（MSC）と歯周組織構成細胞の細胞機能制御および移植前後の恒常性維持は、歯周組織再生の成否に重要な因子である。平成27年度における本研究では、歯周靭帯細胞(HPL cells)を含む歯周組織構成細胞およびMSCが特徴的に発現しているmicro RNAに焦点を当て、歯周組織構成細胞への分化に重要なmicro RNAを明らかにすることを最終的な目的として、移植に用いるMSCの未分化状態維持および歯周組織構成細胞への分化に対する方向付を制御することで最適な細胞機能の制御方法を確立するという観点から研究を推進した。
平成27年度に行なった研究の具体的な内容として、
1. 歯周組織構成細胞およびMSCにおけるmicro RNA発現プロファイル：歯周組織構成細胞であるヒト歯肉線維芽細胞(HGF)，HPL cells，ヒト骨芽細胞(HOB)，ヒトセメント芽細胞(CEM)およびMSCにおけるMicro RNA発現の網羅的な解析を行なった。MSCと比較して、HPL cells:高発現1種，低発現1種; HGF:低発現13種; HOB:低発現125種; CEM: 高発現2種，低発現15種のmicro RNAが特徴的な発現パターンを示した。MSCにおいては、全ての歯周組織構成細胞と比較して29種のmicro RNAが高発現を示した。
2. Micro RNA発現調整に有効な因子の検討：Micro RNA発現調整因子として歯周組織再生療法に応用されているサイトカインに着目し、刺激時において特徴的に変化するmicro RNAを検出した。特徴的な変化を示したmicro RNAは、FGF2: 増加11種,減少3種; BMP2: 増加16種,減少1種; BDNF: 増加8種,減少15種; Amelogenin: 増加9種,減少12種であった。
以上の結果から、歯周組織構成細胞およびMSCに特徴的なmicro RNAおよびサイトカイン刺激により特徴的な変化を示すmicro RNAが同定されたことで、効率的なMSCを用いた歯周組織再生療法が期待される。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

平成27年度における研究により、
1．歯周組織構成細胞におけるmicro RNA発現プロファイル：歯周組織構成細胞であるヒト歯肉線維芽細胞(HGF)，ヒト歯周靭帯細胞(HPL cells)，ヒト骨芽細胞(HOB)，ヒトセメント芽細胞(CEM)およびMSCにおけるMicro RNA発現の網羅的な解析を行なった。得られた結果として、MSCと比較して、HPL cells: 高発現1種，低発現1種; HGF: 高発現0種，低発現13種; HOB: 高発現0種，低発現125種; CEM: 高発現2種，低発現15種のmicro RNAが特徴的な発現パターンを示した。
2．間葉系幹細胞MSCにおけるmicro RNA発現プロファイル：MSCにおいて、全ての歯周組織構成細胞と比較して29種のmicro RNAが高発現を示した。
3．細胞分化および機能維持に重要なmicro RNAの同定：歯周組織構成細胞およびMSCにおいて特徴的な発現を示すmicro RNAのうち、もっとも特異的な発現を示したmicroRNAとして、HPL cells: miR-199a; HGF: miR-146; HOB: miR-21, miR-130; CEM: miR-628, miR-155, miR-126; MSC: miR-130aを同定した。
4．Micro RNA発現調整に有効な因子の検討：Micro RNA発現調整因子として歯周組織再生療法に応用されているサイトカインに着目し、サイトカイン刺激時において特徴的に変化するmicro RNAを検出した。平成27年度においては、サイトカインは、FGF2, BMP2, BDNFおよび歯周組織再生療法に用いられるエナメルマトリックス蛋白の主成分であるAmelogeninを用いた。無刺激時と比較して特徴的な変化を示したmicro RNAは、FGF2: 増加11種, 減少3種: BMP2: 増加16種, 減少1種; BDNF: 増加8種, 減少15種; Amelogenin: 増加9種, 減少12種であった。
これらの結果は、交付申請時の平成27年度研究実施計画をほぼ満たしており、また、一部平成28年度研究実施計画に及んでいるため、現在までの達成度は当初の計画以上に進展していると考える。

Strategy for Future Research Activity

平成28および29年度は以下の研究内容を推進する予定である。
1. 細胞分化および機能維持に重要なmicro RNAの同定：平成27年度において歯周組織構成細胞およびMSCに特徴的なmicro RNAが同定されたので、それぞれの細胞に対する遺伝子導入によってmicro RNAの発現調整を行ない、必要な細胞機能の評価を行なう。骨芽細胞, 歯周靭帯細胞, セメント芽細胞への分化およびMSCにおける未分化状態維持に関する検討を行なう。
2. Micro RNA発現調整に有効な因子の検討：平成27年度に引き続き、サイトカイン刺激によるmicro RNA発現に対する影響を検討する。未分化状態維持に影響する因子として低酸素, 塩化コバルトおよびNogginを用い、サイトカインはPDGF, TGF-b1, TGF-b3およびIGF-1を用いる。
3. Micro RNA発現調整細胞の未分化維持および分化の方向付けの検討：種々の刺激因子によってmicro RNA発現を調整したMSCに対し、micro RNAプロファイリングで同定したmicro RNA群に対する分化の方向付および未分化状態維持への影響を検討する。なお、分化の方向付けに関しては、移植により再生が望まれる骨・セメント質および歯周靭帯の均整が保たれることに焦点を当てる。遺伝子導入によって同定されたmicro RNAの発現調整を行ない、骨芽細胞, 歯周靭帯細胞, セメント芽細胞への分化およびMSCにおける未分化状態維持に関する検討を行なう。
4. Micro RNA発現プロファイルの分類：MSCのmicro RNA発現プロファイルおよび発現調整因子によるmicro RNA発現パターンの変化を分析し、カテゴリー分類を行なうことによって発現プロファイルとMSCに対する最適な刺激因子を相関させ、最終的には、MSC移植における適切な前処理という観点から最適な刺激因子を選択する。
更に、平成27年度から29年度の3年間で得られた研究結果を取りまとめ、研究成果の発表を行なう。