2015 Fiscal Year Research-status Report
培養表面のstiffness（剛性）による歯根膜由来細胞の分化制御
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15K11224
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| Research Institution | Tokyo Women's Medical University |
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Principal Investigator |
岩田 隆紀 東京女子医科大学, 医学部, 准教授 (60431946)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鷲尾 薫 東京女子医科大学, 医学部, 講師 (50514486)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 剛性 / 間葉系幹細胞 / 分化制御 / 再生医療 / 細胞移植 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒト間葉系幹細胞（human multipotent mesenchymal stromal cells: hMSC）はさまざまな組織より採取可能な細胞集団であり、その再生医療への応用は世界中で実施されている。主に骨髄や脂肪組織由来の細胞を用いた治療が歴史的に古く研究も進んでいるが、他の臓器からも採取・培養増殖・移植可能な細胞が多数報告されている。
私共は歯周組織の再生のために歯根膜組織由来の間葉系幹細胞に着目し、骨芽細胞分化培地にて前培養した後に移植する術式を考案してきたが、近年では生物学的なアプローチで間葉系幹細胞の分化制御を行う以外にも、工学的技術を用いて細胞接着面の形状や表面硬さを変化させることにより間葉系幹細胞の分化を制御できることが相次いで報告されてきている。
そこで本研究では培養皿表面などのstiffness（剛性）がヒト歯根膜由来間葉系幹細胞の分化に与える影響を解析し、歯周組織再生において最適な移植条件を見出す目的で研究を進めている。現在までにヒト歯根膜由来間葉系幹細胞を採取し、通常の培養条件で培養したのちに凍結保存を進めてきた。また、その後表面硬さの異なる培養皿を用いて、表面硬さの細胞増殖・分化に与える影響を検出するとともに、次世代シークエンサーを用いて網羅的に遺伝子発現を解析し、分化に影響を与える遺伝子のクラスタリングを完了した。今後は表面硬さによって発現の異なる遺伝子の同定ならびにその機能解析を実施していく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本学倫理委員会承認後、智歯よりヒト歯根膜由来間葉系幹細胞を抽出し、サンプルとした。3－5回継代した細胞を用いて細胞増殖・多分化能（ここでは骨芽細胞分化と脂肪細胞分化）などを各stiffnessの培養皿を用いて検証し、過去の報告と照らし合わせ、実験系の整合性を確認した。stiffnessが堅ければ堅いほど骨芽細胞分化の促進が観察された。
２．次世代シークエンサーによるStiffnessの遺伝子発現へ与える影響の解析
本学で所有している次世代シークエンサー（イオントレント）を用いて、網羅的遺伝子発現解析を実施し、各種stiffnessにおける遺伝子発現の差異を定量的に解析するためのサンプル調製を実施した。その中では、各種stiffnessによる遺伝子発現の差が観察され、解析手法としてはGO分析を実施し、変化のある遺伝子群のクラスタリングを実施した。また、stiffnessの異なる培養表面において、骨芽細胞分化ならびに靭帯細胞分化におけるhPDL-MSCの遺伝子発現変化の定量を次世代シークエンサーを用いて解析し、上記のようなGO解析およびクラスタリングを実施した。本研究では過去の一般的な培養容器での解析をリファレンスとして活用し、stiffnessの違いによってどのような遺伝子発現の差異が見られるかを、骨芽細胞分化誘導時ならびに靭帯細胞分化時に採取したRNAを用いて解析を実施した。特に本研究においては分化初期に発現の変動する遺伝子（主に転写因子）に着目して、その機能解析をsiRNAを用いて現在実施している。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成２８年度では歯周組織を再生するための間葉系幹細胞の分化誘導方法やその期間の最適化を実施するとともに、それを成し得るための最適な剛性を算出し、培養皿上にハイドロゲルなどを用いて最適な硬さ表面を構築する。
平成２９年度ではそれまでに培ってきた培養技術を用いて最適な細胞シートを作製し、移植実験を行い、データをまとめて、国際学会などで発表するとともに学術雑誌への論文投稿を行う。
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| Causes of Carryover |
残額が8,831円となったが、来年度においてガラス培養基材（本年度実績188,568円）を追加購入する必要があるため、年度内に使い切ることを諦めました。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
来年度においてガラス培養基材（本年度実績188,568円）を追加購入する予定です。
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