骨代謝阻害薬のVEGFR2を介したVEGF-VEGFRシグナルの制御機構の解明

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K11249
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 中川 貴之 広島大学, 大学病院, 病院助教 (30456230)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 武知 正晃 広島大学, 医歯薬保健学研究院(歯), 准教授 (00304535) ; 太田 耕司 広島大学, 大学病院, 病院助教 (20335681)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 骨代謝阻害薬関連顎骨壊死

Outline of Annual Research Achievements

ヒト型抗RANKLモノクローナル抗体であるデノスマブは，ビスフォスフォネート(BP)注射剤と顎骨壊死の発生が同頻度であり，破骨細胞の生存・分化におけるRANKLシグナル経路の障害が顎骨壊死に関与していると示唆される．これまでわれわれはゾレドロン酸に影響を受けるRANKLシグナル分子の同定のため，マイクロアレイを用いた網羅的な解析を行い，Nfatc1とCar2の2遺伝子がゾレドロン酸の破骨細胞分化阻害に伴い発現が低下することを明らかにした．さらにマイクロアレイの結果を詳細に検討し，VEGFR2がRANKLによる破骨細胞分化に関与する可能性を見出した．本研究ではVEGF-VEGFRシグナルとRANKL誘導破骨細胞分化との関連について研究を行い，骨代謝阻害薬関連顎骨壊死の病態を解明することを目的として研究をすすめている．
平成27年度はデノスマブがヒト由来の破骨細胞にしか奏功しないため，健常人より採取した末梢血から破骨前駆細胞を多く含むと考えられているCD11b陽性細胞を抽出し破骨細胞へと分化誘導を行う実験系の構築とデノスマブによる破骨細胞形成阻害をきたす至適濃度の検討を行った．さらに再度マイクロアレイの結果を詳細に検討し，NFATc1の値をカットオフとして(RANKL/ZOL+RANKL=2.11)，ゾレドロン酸非投与群に比べ投与群において発現低下が著明であった22遺伝子について未解析であったものについてrealtimePCRによるmRNA発現解析とwestern blottingでのタンパク発現解析による検証を行ったところ，新たにRnf183遺伝子においてゾレドロン酸非投与群に比べ投与群において発現低下がみられた．

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

健常人の末梢血からDensity gradient法および吸着法で末梢血単核球を分離培養し，破骨細胞への分化誘導を行う方法は簡便である一方で分化効率が悪く，また細胞濃度の均一化が困難であった．このため当初の計画を変更し，Density gradient法に加え，Magnetic Cell Sorting法でヒト破骨前駆細胞の細胞表面マーカーと考えられているCD11bの陽性細胞を抽出し破骨細胞への分化誘導を行った．その結果，Density gradient法と吸着法のみと比較してより高率に破骨細胞へ分化することが確認できた．現在はゾレドロン酸やデノスマブ投与下でのTRAP assayによる形態的な，またpit formation assayにより機能的な破骨細胞への分化の検討を継続している．
またマイクロアレイの結果抽出した候補遺伝子22個のうち，研究計画ではすでにその機能が既知であった遺伝子においてはmRNAおよびタンパク発現解析の結果，その発現が骨代謝阻害薬に依存しないとの結果を得られていたが，機能が未知，あるいは未解明な要素があるため解析を行っていなかったものも含めすべてについてrealtimePCR法でmRNA発現解析とWestern Blotting法によるタンパク発現解析の2段階のスクリーニングを行った結果,新たにRnf183遺伝子がゾレドロン酸による発現抑制を受けることが明らかとなった．
これらの2つの実験系は研究計画書に未載な部分もあるが，本研究をすすめる上で重要な事項であり，進捗としてやや遅れが生じているのはこれらの実験を慎重に進めていたからである．

Strategy for Future Research Activity

現在Magnetic Cell Sorting法によるヒト破骨前駆細胞の抽出の効率化に成功したが，1回に抽出できる細胞数は限られているため，分化誘導実験，遺伝子発現解析のためには頻回の採血が必要である．検体提供者の苦痛にも配慮すべきであり，そのためには時間をかけてより綿密な実験計画を立案することが肝要である．
現在行っている破骨細胞分化誘導実験では，形態学的にゾレドロン酸では前駆細胞のアポトーシスが誘導されているが，デノスマブではアポトーシスはみられない．またデノスマブではRANKLによる分化誘導によりTRAP陽性細胞は観察されるが，多核化を認めるものがない．これらの結果についてザイモサン貪食実験など当初の研究計画に含めなかった解析が必要となる可能性がある．また遺伝子発現解析に関してはVEGFR2遺伝子に加えRNF183遺伝子も候補遺伝子と考えられる．RNF183遺伝子はユビキチンリガーゼの結合に関与している可能性が示唆されているが現在その機能は完全には明らかになっていない．このため今後種々の実験で得られる結果に応じて柔軟に実験計画を立案する予定としている．