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2015 Fiscal Year Research-status Report

無血清浮遊培養系でのCD133陽性口腔癌由来sphereの細胞内分泌学的特性解析

Research Project

Project/Area Number 15K11251
Research InstitutionHiroshima University

Principal Investigator

虎谷 茂昭  広島大学, 医歯薬保健学研究院(歯), 准教授 (90172220)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 岡本 哲治  広島大学, 医歯薬学保健学研究院(歯), 教授 (00169153)
Project Period (FY) 2015-04-01 – 2018-03-31
Keywords癌幹細胞 / CD133 / 口腔癌 / 無血清浮遊培養
Outline of Annual Research Achievements

がん幹細胞は、がん治療における新たな標的細胞として注目されている。CD133 は癌幹細胞の有力なマーカーとして考えられており、本研究では、ヒト口腔扁平上皮癌OSCC 細胞株由来 CD133 陽性細胞(CD133+細胞)の機能解析について検討する予定である。
OSCC親株(KO、NA、UE)をマグネティックビーズ付抗CD133抗体で処理後autoMACS(ミルテニー)を用いてCD133+細胞を分離した。CD133蛋白の発現を免疫組織学的に検討し、本分離方法によりCD133陽性細胞(CD133+)が再現性よく分離されていることを確認した。さらにCD133+細胞の全細胞中に占める細胞数の比率はわずか約0.5%であることを明らかにした。
CD133+細胞は通常の単層培養系ではCD133-細胞や親細胞に比べ低い増殖能であった。また無血清培養下、CD133+細胞と CD133-細胞間で浮遊培養系での浮遊細胞塊(sphere)形成能を比較した結果、CD133+細胞は浮遊培養系で高いsphere 形成能を示したが、CD133-細胞のみでは sphereをまったく形成しなかった。培養開始時に、CD133-細胞に CD133+細胞を加えることでsphere 形成能を獲得した。興味あることに、sphere数および大きさがプラトーとなった時のsphere中のCD133+細胞の占める割合は親細胞株におけるCD133+細胞の比率と同等の0.5%であった。
またsphere形成能をもつCD133+細胞とsphere形成能を持たないCD133-細胞を各々浮遊培養後、10乗個の細胞をヌードマウス背部皮下に移植すると、CD133+細胞を含むsphereは、腫瘍の形成を認めたが、CD133-細胞のみでは腫瘍は形成できなかった。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

現在、研究はほぼ順調に実施している。しかし、CD133+細胞が全細胞中0.5%しか存在しないこと、分離したCD133+細胞を維持しているとCD133-細胞にトランジットしてしまうことから、大量の細胞を必要とするin vivoの研究では、細胞の供給、選別に大きな負担を感じている。

Strategy for Future Research Activity

骨肉腫幹細胞の系ではsphere形成にTGF-β1の関与を(Zhang et al.2013)示唆する報告がある。我々の研究では、sphere形成にはCD133+細胞が必要であり、そのCD133+細胞がCD133-細胞と凝集することでsphere形成が開始する可能性が示唆された。このような機構にはCD133+細胞が産生する液性因子・細胞増殖因子がパラクライン的に関与している可能性が考えられる。そこで今年度はCD133+細胞やCD133-細胞が産生する液性因子がsphere形成能に及ぼす影響について明らかにし、sphere形成能に及ぶすCD133+細胞とCD133-細胞の細胞間ネットワークやCD133+細胞やCD133-細胞が産生する液性因子の生物学的特性に及ぼす影響やそのについて解析する。
まずCD133+細胞とCD133-細胞の遺伝子、蛋白発現についてDNAマイクロアレイ、プロテオーム解析により相違を明らかにする。さらに、これらの液性因子および受容体遺伝子に対する中和抗体やsiRNAを用いて、CD133+細胞およびCD133-細胞での遺伝子発現をノックダウンし、それぞれのsphere形成能やその他の生物学的特性を解析することにより同定した液性因子の機能を明らかにする。
そしてヌードマウスの皮下移植モデルを用いてsphereと同定した液性因子を混合した後に移植し、形成された腫瘍の動態や、その浸潤能および転移能を解析する。

Causes of Carryover

CD133+細胞の大量培養にやや時間が要するため、in vivo の研究に使用するヌードマウスの購入を控えていたこと、蛋白発現をみるプロテオーム解析や免疫染色の準備がまだできていないためた抗体や薬品の購入がまだ行えていないことが理由である。

Expenditure Plan for Carryover Budget

CD133+細胞あるいはCD133-細胞が産生する液性因子・細胞増殖因子がパラクライン的に関与している可能性が考えられる。
従って、これらの細胞が産生する液性因子と液性因子受容体の分析と、同定された因子によるCD133+細胞によるsphere形成能の亢進、腫瘍細胞の増殖および造腫瘍性への関与などの生物学的特性に及ぼす影響についても明らかにする。そのために必要な、これら同定された因子に対する抗体の購入と造腫瘍性の検討のための動物の購入を予定している。

  • Research Products

    (8 results)

All 2016 2015

All Journal Article (4 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Peer Reviewed: 4 results,  Acknowledgement Compliant: 1 results,  Open Access: 1 results) Presentation (4 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results)

  • [Journal Article] Photodynamic therapy using Photofrin and excimer dye laser treatment for superficial oral squamous cell carcinomas with long-term follow up2016

    • Author(s)
      Toratani S, Tani R, Kanda T, koizumi K, Yoshioka Y, Okamoto T
    • Journal Title

      Photodiagnosis and Photodynamic Therapy

      Volume: 14 Pages: 104-110

    • DOI

      10.1016/j.pdpdt.2015.12.009

    • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] Generation of cleidocranial dysplasia-specific human induced pluripotent stem cells in completely serum-, feeder-, and integration-free culture.2015

    • Author(s)
      Yamasaki S, Hamada A, Akagi E, Nakatao H, Ohtaka M, Nishimura K, Nakanishi M, Toratani S, Okamoto T.
    • Journal Title

      In Vitro Cell Dev Biol Anim.

      Volume: 52 Pages: 252-264

    • DOI

      10.1007/s11626-015-9968-x.

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Eldecalcitol (ED-71), an Analog of 1α, 25-dihydroxyvitamin D3 as a Potential Anti-cancer Agent for Oral Squamous Cell Carcinomas.2015

    • Author(s)
      Shintani T, S.N.Z. Rosli, Takatsu F, Choon Y.F, Hayashido Y, Toratani S, Usui E, and Okamoto T
    • Journal Title

      J Steroid Biochem Mol Biol

      Volume: 9 Pages: in press

    • DOI

      10.1016/j.jsbmb.2015.09.043.

    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Comparison of the prognosis of bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw caused by oral and intravenous bisphosphonates.2015

    • Author(s)
      Shintani T, Hayashido Y, Mukasa H, Akagi E, Hoshino M, Ishida Y, Hamana T, Okamoto K, Kanda T, Koizumi k, Yoshioka Y, Tani R, Toratani S, Okamoto T.
    • Journal Title

      Int J Oral Maxillofac Surg

      Volume: 44 Pages: 840-844

    • DOI

      10.1016/j.ijom.2015.03.013.

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] インテグレーションフリー・フィーダーフリー・無血清培養系での疾患特異的iPS細胞の樹立2015

    • Author(s)
      中峠洋隆、大林史誠、安井多恵子、赤木恵理、山崎佐知子、大高真奈美、中西真人、虎谷茂昭、岡本哲治
    • Organizer
      第52回日本口腔組織培養学会
    • Place of Presentation
      徳島
    • Year and Date
      2015-11-21 – 2015-11-21
  • [Presentation] フィーダー細胞フリー・無血清培養でのヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)の誘導と長期培養 宿主細胞およびウイルスベクターの比較2015

    • Author(s)
      赤木恵理、山崎佐知子、濱田充子、中峠洋隆、大林史誠、安井多恵子、田口有紀、大高真奈美、西村健、中西真人、谷亮治、虎谷茂昭、岡本哲治
    • Organizer
      第52回日本口腔組織培養学会
    • Place of Presentation
      徳島
    • Year and Date
      2015-11-21 – 2015-11-21
  • [Presentation] 口腔扁平上皮癌細胞(OSCC)におけるrBC2LCNの癌幹細胞マーカーとしての有用性の検討2015

    • Author(s)
      中峠洋隆、山崎佐知子、赤木恵理、濱田充子、虎谷茂昭、岡本哲治
    • Organizer
      第69回NPO法人日本口腔科学会学術集会
    • Place of Presentation
      大阪
    • Year and Date
      2015-05-13 – 2015-05-15
  • [Presentation] Eldecalcitol (ED-71), an Analog of 1α,25-dihydroxyvitamin D3 as a Potential Anti-Cancer Agent for Oral Squamous Cell Carcinomas (OSCC)2015

    • Author(s)
      Rosli S.N.Z. F. Takatsu , S. Toratani, Choon Y.F. E. Usui, T. Okamoto
    • Organizer
      VitaminD Workshop
    • Place of Presentation
      Delft, Netherlands
    • Year and Date
      2015-04-21 – 2015-04-24
    • Int'l Joint Research

URL: 

Published: 2017-01-06  

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