2015 Fiscal Year Research-status Report
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15K11259
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
田村 潔美 熊本大学, 発生医学研究所, 助教 (90399973)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 血管新生 / 細胞伸長 / 血管内皮細胞 / ＥＳ細胞 / SM22 / ミオシン軽鎖 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
血管内皮細胞の伸長・紐状構造の形成は、機能的な血管の構築につながる重要な過程であるが、その調節メカニズムについての知見は少ない。申請者は、細胞骨格の調節因子であるPPP1R14と、平滑筋細胞マーカーとして知られるSM22αが、血管内皮細胞の伸長促進にも関与することを見いだしている。この二つの因子の転写調節配列には、配列類似性が非常に高い領域が存在することから、これらの配列を解析することで、血管伸長を誘導する複数の因子を統合的に調節できる転写因子群と、その応答配列「伸長モチーフ」を同定できるのではないかと考えた。近年、再生医療による組織の回復が応用されつつあるが、組織の再生には、その内部に酸素や栄養を供給する血管網が必要不可欠である。血管誘導のために、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）等の増殖因子を用いる方法が試みられているが、増殖因子の機能は、増殖・分化から形態調節まで多岐にわたるため、未成熟な血管の過形成が問題となっている (Chung et al., Cells, vol. 1, p1246-1260, 2012)。そこで申請者は、血管伸張を特異的に制御するメカニズムを解明することで、成熟した機能的な血管の誘導による組織再生に貢献できると考えた。本研究では、マウスES細胞の試験管内分化系と株化細胞を用いた解析によって、血管伸長の統合的な制御機構を明らかにする。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、ES細胞を用いた血管伸張の調節機構の解析を目的とした解析を行った。
◆ 【血管内皮細胞におけるPPP1R14関連因子、SM22αの発現の検討】ES細胞由来の血管内皮細胞、血管内皮細胞株、マウス網膜の血管内皮細胞、また胎生11.5日目のマウス胚の免疫抗体染色を行い、PPP1R14によって調節されるリン酸化ミオシン軽鎖とSM22αの血管内皮細胞における発現を解析した。
◆ 【血管伸張に特異的な転写因子応答配列の検討】転写因子結合配列予測プログラムによって、PPP1R14エンハンサーとSM22αプロモーターの配列に共通して配列類似性が高い領域の存在が予測されたため、この配列を中心に、フラグメント化したSM22αプロモーターについて、血管内皮細胞株と血管壁細胞株を用いた、ルシフェラーゼレポーターアッセイによる転写活性測定を行った。その結果、血管内皮細胞と血管壁細胞におけるフラグメント化SM22αプロモーターの相対的な活性は、ほぼ同様であることが示された。
◆【血管伸長を調節するメカニズムの検討】ES細胞由来血管内皮細胞を用いた薬剤スクリーニングの結果、LY294002 、Akt Inhibitor VIII 、everolimus、Rapamycinの4種を血管伸長を促進する阻害剤として同定し、これら阻害剤の機能から、血管伸張を抑制する2つの経路を示した。一つは、PI3K/AktによってFoxo1を抑制することで伸長を阻害する経路であり、もう一つは、mTORC1によってmTORC2を抑制することによって伸長を阻害する経路である。また、これら２つの経路はいずれも、Rho/ROCKを介したアクチン細胞骨格のリモデリングを制御していることを示した（in press）。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は、血管伸長に特異的な調節機構の同定を行う。
前年度の研究によって、SM22αプロモーターのフラグメント配列には血管内皮細胞・壁細胞での相対的な活性の違いがないことが明らかになった。そこで次年度は、血管内皮細胞株と血管壁細胞株を用いて、無血清培養での成長因子・サイトカイン投与効果のスクリーニングを行い、どちらか一方の細胞種にのみ細胞形態に影響を与える因子の選択を行う。用いる血管内皮細胞・壁細胞株はいづれも、SM22αプロモーター活性、SM22α mRNAとSM22α蛋白質の発現が確認されているため（未発表）、増殖因子・サイトカインの細胞種による効果の違いによって、SM22α発現調節機構の違いが予測できると考えている。また、伸長形態を維持した血管内皮細胞株を用いて、mTORC2の細胞形態における機能の詳細を明らかにする。
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Research Products
(2 results)
