2015 Fiscal Year Research-status Report
新規骨代謝疾患治療薬開発に向けたβグルカンによる破骨細胞分化制御機構の解明
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15K11263
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| Research Institution | Kyushu Dental College |
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Principal Investigator |
有吉 渉 九州歯科大学, 歯学部, 准教授 (40405551)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 破骨細胞 / curdlan / dectin-1 / オートファジー / spleen tyrosine kinase / エンドサイトーシス / PI3-kinase |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまで我々は、破骨細胞前駆細胞をはじめ、樹状細胞やマクロファージに特異的に発現しているC-typeレクチン受容体の1つであるdectin-1のリガンドで、直鎖のβ-1,3 glucanであるcurdlanが、破骨細胞の形成を負に制御すること、さらにそのメカニズムとして、spleen tyrosine kinase (Syk)タンパクの分解が関与していることを報告した。そこで、curdlanによるSykタンパクの分解機構について検討を行った。
破骨細胞前駆細胞RAW264.7細胞のdectn-1過剰発現株（d-RAW）を樹立し、curdlanを添加して培養を行ったところ、Sykのタンパク発現量が著明に減少した。この現象はcurdlan添加後、短時間で生じ、curdlanによる遺伝子レベルでのSykの発現抑制は観察されなかった。そこで、細胞内分解系による制御を考え、オートファジー・リソソーム系の阻害薬であるbafilomycin A1で前処理を行ったところ、curdlan添加によるSykタンパクの発現減少は回復した。その一方で、プロテアソーム阻害薬であるMG132の前処理群では、Sykタンパクの発現の変化が観察されず、curdlanの添加によるSykタンパクの分解が、オートファジー・リソソーム系に依存していることが明らかとなった。このことはcurdlanの添加により、d-RAWにおいて、オートファゴソーム・オートリソソームのマーカーであるLC3-Ⅱの形成が増加することからも支持された。さらに、オートファゴソームによるバルク分解系の誘導に分解のターゲット分子であるSykのリン酸化が関与している可能性も示唆された。
これらの結果より、curdlan-dectin-1の相互作用による破骨細胞分化抑制に、オートファジー・リソソーム系の活性化が関与しているという新たな知見が得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成27年度の目標は、「curdlanに誘導されるオートファジーを介したSyk分解機構の解明」であり、破骨細胞前駆細胞株を用いて、オートファジーの阻害実験、オートファジー関連分子の発現や機能の同定を行い、curdlanによるSykの分解にオートファジーを介したタンパク分解機構が関与していることを証明することであった。「研究実績の概要」の項目に示すように、阻害実験により、curdlan-dectin-1の相互作用によるSykタンパクの分解に、オートファジー・リソソーム系の活性化が関与していることに加え、これを支持する因子として、curdlan添加による破骨細胞前駆細胞内のLC3-Ⅱの形成亢進を明らかにした。さらに、分解のターゲット分子であるSykのリン酸化がcurdlanによるオートファジーの誘導に関与していることを示唆する所見が得られ、これはタンパクのリン酸化が、タンパク分解系のターゲッティングの制御に関与している観点からも興味深い結果と言える。
こうした観点から、当該研究の進捗状況についてはおおむね順調に進展していると考えられる。ただし、オートファジー誘導によるLC3-Ⅱ形成後の細胞内局在に関する評価が完了していない点等、curdlanによる破骨細胞分化抑制メカニズムの詳細を評価する上で、追加しなければならない検討項目はまだ残されている。さらに、細胞内代謝システムの統合的な制御メカニズム解明のために、オートファゴソーム形成とエンドサイトーシス経路との相関について、Atg分子群および、Ⅲ型PI3キナーゼ（PI3K）を中心に解明を行っていく。
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| Strategy for Future Research Activity |
LC3-Ⅱの細胞内動態および局在の解明のため、培養後のd-RAWに対して、GFP-LC3を用いた蛍光染色法を行い、オートファゴソーム形成を観察する。
一方、オートファゴソーム膜には、リン脂質であるフォスファチジルイノシトール３リン酸（PI3P）が含まれ、それを産生するPI3Kがオートファゴソーム形成に必須であることが報告されている。この酵素はBeclin1やp150 、及びAtg14様タンパク質と複合体を形成し、オートファジーを制御する。平成28年度の研究では、PI3Kの阻害剤である3-メチルアデニン（3-MA）で前処理を行ったd-RAWに対して、curdlan添加後のSykタンパクの発現を検討し、オートファジーの誘導に対するPI3Kシグナリングの活性化の関与を検討する。
また、細胞内の代謝システムの統合的な制御には、オートファジーと並んで、細胞外物質を取り込み、リソソームに輸送するエンドサイトーシスによる制御が関わっている。近年の研究で、PI3K複合体は、結合する相手を変えることにより、オートファジーだけでなくエンドサイトーシス経路も制御することが明らかとなっている。そこで、カベオラ依存性エンドサイトーシス阻害剤であるMethyl-β-cyclodextrinの前処理を行い、 curdlan添加によるSykタンパクの発現を検討し、オートファジーとエンドサイトーシスの代謝経路の相互作用について検討する。さらに、培養を行ったd-RAWに対して、Early endosome antigen 1抗体を用いて、エンドソームを標識し、エンドサイトーシス形成の細胞内動態を観察するとともに、膜トラフィック関連分子であるrab7、beclin-1、atg14の遺伝子発現についてreal-time RT-PCR法を用いて定量する。
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