口腔扁平上皮癌におけるRNA編集異常と悪性化進展機構への関与

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K11265
• Research Institution: Health Sciences University of Hokkaido
• Principal Investigator: 奥村 一彦 北海道医療大学, 歯学部, 准教授 (60194510)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 磯貝 恵美子 東北大学, 農学研究科, 教授 (80113570)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: RNA編集異常 / ADAR1遺伝子 / レンチウイルスベクター / 造腫瘍活性 / 細胞増殖活性 / 細胞遊走能 / 基底膜浸潤能

Outline of Annual Research Achievements

浸潤性が異なる SAS-H1 細胞と SAS-L1 細胞におけるADAR1(p110 アイソフォーム)遺伝子発現を比較検討したところ、SAS-L1細胞で、ADAR1遺伝子及び蛋白質の発現が減弱していることが確認された。そこで、レンチウイルス・ベクターを用いて、SAS-L1 細胞に ADAR1遺伝子を導入し、ADAR1 高発現癌細胞を作製することとした。昨年度、何度か試みたが導入効率が低く難渋していたが、、幾つかのコロニーが得られたうち発現効率が高いクローンを得ることができた。ADAR1 高発現癌細胞であることを RT-PCR および定量 RT-PCR 法で ADAR1mRNA の高発現、また、ウエスタンブロット 法で ADAR1 蛋白質の高発現を確認することができた。ADAR1 高発現SAS-L1細胞を用いて寒天培地上でフォーカス・アッセ イ、及びコロニーアッセイを施行し in vitro での 腫瘍形成能を検討したところ、コントロールベクター導入SAS-L1細胞に比較して、造腫瘍性が亢進していることを確認した。。また、細胞増殖活性、 細胞遊走能、基底膜浸潤能について、各々コントロールベクター導入SAS-L1細胞との比較 したところ、いずれも亢進していることを明らかにした。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

昨年度、レンチウイルスベクターによる遺伝子導入実験に難渋していたが、繰り返し導入を図ったところ、ADAR1高発現SASl1細胞のクローンを得られることができた。これにより、遅延していた計画を当初の予定に沿って、検証を行うことができた。

Strategy for Future Research Activity

本年度計画していた高浸潤性癌細胞SAS-H1に、RNA干渉法によるADAR1発現の特異的ノックダウンを行い、SAS-L1細胞で確認されたADAR1遺伝子の機能を再確認する予定である。ADAR1ノックダウン細胞を用いて、寒天培地上でフ ォーカス・アッセイとコロニーアッセイを施行し、in vitro での 腫瘍形成能を検討する。また、 細胞増殖活性、細胞遊走能、基底膜浸潤能の変化を確認し、細胞が産生分泌する基質分解酵素産生能について検討する予定である。このことから、ADAR1 遺伝子が口腔扁平上皮癌細胞の悪性化進展の標的遺伝子として機能していることを明らかにしたい。

Causes of Carryover

初年度の計画であったADAR1遺伝子導入について、レンチウイルスベクターによる導入に何度か失敗したため、大幅な研究計画に変更を生じてしまった。しかし、同じレンチウイルスベクターにより、その後ADAR1高発現細胞クローンが得られた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

高浸潤性癌細胞SAS-H1に、RNA干渉法によるADAR1発現の特異的ノックダウンを行い、SAS-L1細胞で確認されたADAR1遺伝子の機能を再確認する予定である。ADAR1ノックダウン細胞を用いて、寒天培地上でフ ォーカス・アッセイとコロニーアッセイを施行し、in vitro での 腫瘍形成能を検討する。また、 細胞増殖活性、細胞遊走能、基底膜浸潤能の変化を確認し、細胞が産生分泌する基質分解酵素産生能について検討する予定である。さらに、ADAR1の標的転写産物について、現在知られている細胞質性 FMR-1 結合蛋白 2(CYFP2)、 フィラミン A、フィラミン B、膀胱癌関連蛋白質(BLCAP)、アンチザイム阻害物質 1(AZIN1)につい て、RNA 編集異常の有無を PCR 産物からのダイレクト・シークエンス法で解析する予定である。

Research Products

• [Journal Article] miR-663a regulates growth of colon cancer cells, after administration of antimicrobial peptides, by targeting CXCR4-p21 pathway. (2017)
  • Author(s): Kuroda K., Tomokazu Fukuda T., Krstic-Demonacos M., Demonacos C., Okumura K., Esogai H., Hayashi M., Saito K., Isogai E.
  • Journal Title: BMC Cancer Volume: 17:33 Pages: 1-10
  • DOI: 10.1186/s12885-016-3003-9
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research