口腔扁平上皮癌におけるRNA編集異常と悪性化進展機構への関与

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K11265
• Research Institution: Health Sciences University of Hokkaido
• Principal Investigator: 奥村 一彦 北海道医療大学, 歯学部, 教授 (60194510)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 磯貝 恵美子 東北大学, 農学研究科, 教授 (80113570)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: RNA編集異常 / 癌の悪性化進展 / ADAR1 / AZIN1

Outline of Annual Research Achievements

① ADAR1 高発現である高浸潤性癌細胞 SAS-H1 に、RNA 干渉法による ADAR1 特異的遺伝子ノックダウンを行い、悪性化進展の抑制がみられるか検討した。ADAR1 遺伝子に特異性を持つショート・ ヘアピン RNAs(shRNA)構造を持つ siRNA を数種合成し、ノックダウン効率が高い siRNA を電気穿孔 法で細胞内に導入した。本細胞とスクランブル shRNA 導入細胞との比較を行い、寒天培地上でフ ォーカス・アッセイとコロニーアッセイを施行し、in vitro で造腫瘍形成能が亢進した。また、 ADAR1 高発現である高浸潤性癌細胞 SAS-H1の基質分解酵素産生能について検討したところ、MMP-9活性が亢進していた。
② ADAR1( p110 アイソフォーム)遺伝子を導入した高発現細胞 SAS-H1 と SAS-L1 を用いて、ADAR1 の標的転写産物である細胞質性 FMR-1 結合蛋白 2(CYFP2)、 フィラミン A、フィラミン B、膀胱癌関連蛋白質(BLCAP)、アンチザイム阻害物質 1(AZIN1)について、RNA 編集異常の有無を PCR 産物からのダイレクト・シークエンス法で解析しようとしたが、塩基配列読み取りができず難渋したので、再度追加して解析をする予定である。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

歯学部6年生国家試験対策委員として、通年の授業計画策定とその実施に向けて約80%の時間を消費す る結果となってしまいました。このため、当初予定していた研究計画の実施が困難となりました。また 、ADAR1 蛋白質の標的転写産物における、RNA 編集異常をPCRを用いたダイレクト・シークエンス法で 解析する予定でしたが、塩基配列の読み取りに難渋し、再度追加実験を予定しています。

Strategy for Future Research Activity

① ダイレクト・シークエンス法によるRNA編集異常の解析：ADAR1 蛋白質の標的転写産物である細胞質性 FMR-1 結合蛋白 2(CYFP2)、 フィラミン A、フィラミン B、膀胱癌関連蛋白質(BLCAP)、アンチザイム阻害物質 1(AZIN1)について、RNA編集異常の有無を解析する。
② RNA編集異常が示唆された転写産物に対して、RNA干渉法による特異的遺伝子ノックダウンとともに、RNA編集異常のある転写物質質の遺伝子を導入することで、RNA編集異常が癌細胞の悪性化進展機構の中心的な役割を担っていることを検証する。
③ RNA編集酵素による機能解析：ADAR1を欠失させた口腔扁平上皮癌細胞株を用いて、増殖能、遊走能、基底膜浸潤能の変化につい評価する。
④ RNA編集異常による造腫瘍性の検討：ADAR1( p110 アイソフォーム)遺伝子を導入した高発現細胞 SAS-H1 と SAS-L1 を用いて、ヌードマウスへの移植を試み、各々の細胞における造腫瘍性を解析する。

Causes of Carryover

歯学部6年生国家試験対策委員として、通年の授業計画策定とその実施に向けて約80%の時間を消費す る結果となってしまいました。このため、当初予定していた研究計画の実施が困難となりました。また 、ADAR1 蛋白質の標的転写産物における、RNA 編集異常をPCRを用いたダイレクト・シークエンス法で 解析する予定でしたが、塩基配列の読み取りに難渋し、再度追加実験を予定しています。
本年度の使用計画としては、ADAR1による標的転写産物の候補としてあげられる細胞質性FMR-1結合蛋白2(CYFP2)、フラミンA、フィラミンB、膀胱癌関連蛋白質(BLCAP)、アンチザイム阻害物質1(AZIN1)について、どの転写産物でRNA編集異常が起きているかをダイレクト・シークエンス法で 解析する。RNA編集異常が示唆された転写産物に対して、RNA干渉法による特異的遺伝子ノックダウンとともに、RNA編集異常のある転写物質質の遺伝子を導入することで、RNA編集異常が癌細胞の悪性化進展機構の中心的な役割を担っていることを検証します。

Research Products

• [Journal Article] miR-663a regulates growth of colon cancer cells, after administration of antimicrobial peptides, by targeting CXCR4-p21 pathway. (2017)
  • Author(s): Kuroda K., Tomokazu Fukuda T., Krstic-Demonacos M., Demonacos C., Okumura K., Esogai H., Hayashi M., Saito K., Isogai E.
  • Journal Title: BMC Cancer Volume: 17:33 Pages: 1-10
  • DOI: 10.1186/s12885-016-3003-9
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research