2016 Fiscal Year Research-status Report
多能性幹細胞の細胞外small RNAに関する基礎的研究
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15K11283
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| Research Institution | Osaka Dental University |
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Principal Investigator |
野崎 中成 大阪歯科大学, 歯学部, 講師 (90281683)
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2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 再生医学 / 幹細胞 / エクソソーム / miRNA / 次世代シークエンス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
多能性幹細胞から遊離するエクソソーム中の機能性RNAを介してどのように細胞間コミュニケーションを図っているかを分子レベルで明らかにするため、胚性幹細胞を用い、細胞外に遊離されるエクソソーム中のsmall RNAを網羅的に解析した。次世代シークエンス解析から得られた50bpのシングルエンドリードは、マウスのレファレンスゲノムへのアライメントを行った。本年度は、small RNAの中でも、miRNAに着目して研究を行った。Parp1の両側アレルをターゲッテングにより欠損させた、Parp1欠損型ES細胞株において、野生型と比べて2倍以上発現が変動しているmiRNAについてさらに解析を進めた。発現が上昇または下降する群に分けて、TargetScan and microRNA.orgの２つのデータベースを用いて、候補となるターゲット遺伝子の予測解析を行った。発現が上昇または下降するmiRNAのターゲット遺伝子数は、各々、810個と716個であった。抽出した候補のターゲット遺伝子を用いて、MAPPFinderによるpathway解析とConPath Navigatorにより経路の視覚化を行った。Parp1欠損下において、miRNA発現上昇群で、MAPK pathwayなど細胞死に関するシグナル伝達経路を含む5個のpathwayが有意に抽出された。GO頻度解析において、細胞死に関するGO termが有意に抽出された。Parp1欠損により、miRNA発現が上昇しているpathway上のターゲット遺伝子の発現は負に制御されることが示唆された。ES細胞においてParp1が欠損すると、細胞死が抑制される可能性がある。Parp1は、細胞外シグナル伝達制御により、エクソソームmiRNAを介して、細胞死の過程に関与していることが示唆された。研究成果の一部は、国内外の学会で報告した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
次世代シークエンス解析から得られたリードを活用し、ターゲット遺伝子の予測解析、そのターゲット遺伝子に共通する生物学的機能を解析した。研究成果の一部は国内外の学会で報告した。平成29年度に予定している、学術雑誌への投稿のための準備段階にある。当初予定していた計画と照らして、おおむね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
エクソソームには、機能性RNAやタンパク質が含まれていて、細胞間の情報伝達機能を持つことが報告され、エクソソーム中の機能性RNAやタンパク質は、疾患や生命現象のバイオマーカーとして注目されている。多能性幹細胞が細胞外の機能性 RNAを介してどのように細胞間コミュニケーションを図っているかを分子レベルで明らかにするため、多能性幹細胞から遊離したエクソソームを抽出し、細胞外で機能するmiRNAを網羅的に解析した。平成28年度に得られた結果を基にして、候補ターゲット遺伝子に共通する生物学的機能を調べ、生物学的経路をマップに表示してデータを視覚化した。平成29年度においては、細胞外miRNAを介した細胞間コミュニケーションにおけるParp1の関与についての研究へ展開する。すなわち、多能性幹細胞の候補ターゲット遺伝子をhypergeometric distribution（超幾何分布）を用いて、統計的に有意なものをさらに絞りこんでいき、その機能へのParp1の関与を評価する。これには、独自に作製した細胞株であるParp1の両側アレルをターゲッテングにより欠損させたES細胞株を用いる。すなわち、細胞外miRNAの機能におけるParp1欠損の影響に焦点を絞り調べるものである。Parp1遺伝子型により発現の差異のあるmiRNAを抽出し、miRNAのターゲットとなるmRNAを指標にして、miRNAの機能をある程度推測できる。Parp1の関与が示唆される遺伝子を制御するmiRNAの発現をリアルタイムPCRで定量的に評価し、Parp1が関与する細胞間コミュニケーションに細胞外で介在するmiRNAを具体的に同定する。miRNAを介したParp1の細胞外機能を解明し、miRNA創薬へ発展させるための一翼を担う基盤的研究を推進する。本研究で得られた成果は、学術誌で報告する予定である。
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| Causes of Carryover |
大学の研究費等も充当したため、当該基金の一部を使用せず翌年度分へ繰り越した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
物品費として、試薬等の消耗品に使用する予定である。最終年度にあたり、本研究で得られた成果を学術誌で報告するため、一部は英文校正費などに使用する予定である。
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