口腔扁平上皮癌におけるMYEOV遺伝子の機能解析

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K11291
• Research Institution: Yamaguchi University
• Principal Investigator: 内田 堅一郎 山口大学, 医学部附属病院, 助教 (20379986)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 竹縄 隆徳 山口大学, 医学部附属病院, 診療助教 (30711270)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 癌 / 遺伝子

Outline of Annual Research Achievements

口腔扁平上皮癌では、比較的狭い染色体領域の著しいコピー数の増加である、増幅と呼ばれる染色体異常が11番染色体に高頻度に生じる。われわれは，増幅が生じる領域にコードされている遺伝子のなかで，MYEOV遺伝子が口腔扁平上皮癌で高発現していることを発見した。MYEOV遺伝子の増幅は他の癌腫でも報告されているが、その役割は不明である。本研究では、MYEOV遺伝子と関連する遺伝子を同定しMYEOV遺伝子との関わりを明らかにする。また、MYEOV遺伝子の口腔扁平上皮癌の発生や進展過程における役割を明らかにする。具体的には口腔扁平上皮癌細胞に、MYEOV遺伝子のKnock downを行い、コントロールとKnock downを行った細胞における遺伝子の発現パターンをRNAシークエンシング法で検討する。さらに、得られた結果をもとにパスウェィ解析を行い、細胞シグナル伝達におけるMYEOVの役割を検索する。MYEOV分子と複合体を形成している分子を共免疫沈降にて回収し、二次元電気泳動およびMALDI-TOF-MSを用いて同定する。MYEOVと関連すると思われる分子に関しては、細胞株および臨床検体のパラフィンブロックを用いて、Western blotting、Real time PCRや免疫染色等の分子細胞遺伝学的手法を用いて検討を行い、MYEOVの発現との関係を明らかにする。さらに、RNA干渉法および遺伝子発現ベクターを用いた遺伝子発現改変技術を応用して、MYEOV遺伝子および関連遺伝子の発現変化と細胞のPhenotypeの変化を検討することにより、MYEOVの生物学的役割を明らかにする。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本年度は培養口腔癌細胞に対してMYEOVのRNA干渉を行い，得られたRNAをRNAシークエンシングに供する予定であった．RNAiの条件，培養口腔癌細胞の増殖に対するMYEOV遺伝子のRNA干渉の影響，RNAシークエンシングに供するための良質なRNAの抽出条件を検討した，本年度はRNAシークエンシングによる解析が施行できなかった．

Strategy for Future Research Activity

口腔癌細胞に対してMYEOV遺伝子のRNA干渉を行い抽出したRNAをRNAシークエンシングに供する。解析結果をもとに、MYEOV遺伝子のKnock downによる各遺伝子のm-RNAの発現量の変化とSplicing variantの出現パターンの変化を検討する。さらに、パスウェイ解析ソフトを用いて、MYEOV遺伝子のKnock downの影響を受ける細胞内シグナル伝達の候補をピックアップする。MYEOV遺伝子と関連する遺伝子および関連するシグナル伝達に関して、複数の細胞株を用いて経時的な変化を検討する。複数の口腔扁平上皮癌細胞に、MYEOV遺伝子のKnock downを行い、導入後24時間、48時間および72時間の時点で、RNAおよび蛋白質を抽出する。RT-qPCR法およびWestern blotting法を用いて、MYEOV遺伝子の発現と関連遺伝子の発現の経時的変化を検討し、両者の関連性を評価する。また、シグナル伝達に関与する分子はリン酸化によりコントロールされていることが多いため、必要に応じてリン酸化抗体を用いたWestern blotting法により、シグナル伝達との関連を検討する。口腔扁平上皮癌症例の手術標本のパラフィンブロックから、切片を作成しMYEOV分子とその関連分子に関して免疫染色による検討を行う。

Causes of Carryover

平成27年度は予定していたRNAシークエンシングを施行できなかったため，その解析費用が次年度使用額となった．

Expenditure Plan for Carryover Budget

平成28年度にRNAシークエンシングを行いその解析費用として用いる予定である．